一种预测rProROL酶促大豆油水解过程水解率的新模型

覃小丽, 李道明, 王永华,钟金锋*

1(西南大学 食品科学学院，重庆,400715)　2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州,510640)

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一种预测rProROL酶促大豆油水解过程水解率的新模型

覃小丽1, 李道明2, 王永华2,钟金锋1*

1(西南大学 食品科学学院，重庆,400715)2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州,510640)

基于重组脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)催化大豆油(甘油三酯，triglyceride，以TAG表示)水解反应过程中反应因素(反应温度、缓冲液pH、缓冲液添加量、反应时间和酶添加量)对TAG水解率的影响，分析了缓冲液pH、缓冲液添加量、反应时间和酶添加量与TAG水解率变化均呈良好的数学关系，据此提出可预测TAG水解率经验模型的表达式。通过对比TAG水解率的实验值与由该数学模型计算的预测值，两者的相关系数为0.914 6，说明了该模型能较好地反映rProROL酶促大豆油水解过程TAG水解率的变化规律。这将为rProROL酶促大豆油水解制备脂肪酸的过程优化控制提供参考。

rProROL脂肪酶(rProROL)；水解反应；预测模型；水解率

酶法催化油脂水解制备脂肪酸是油脂工业的重要研究方向之一。近期研究显示当两种商业化脂肪酶的复配比例为4∶1(Lipozyme RM-IM∶Novozym 435)时，其催化豆油水解反应的水解率在24 h时达到80%以上，但是当这些商业化脂肪酶单独作为催化剂时，其催化大豆油水解的水解率不足50%，且通常需要更长时间(70 h)[1]。针对酶催化效率及其生产成本仍是酶法改性油脂工业的技术障碍这一瓶颈，开发新型脂肪酶或对现有脂肪酶的基因序列改造以获得优异的催化性质(高活性、高稳定性等)的新型或重组脂肪酶对于生物酶法改性油脂工业具有重要意义。ARTHY等[2]研究了来源于Cryptococcussp.的新型脂肪酶催化沙丁鱼油水解制取多不饱和脂肪酸的可行性，在反应至72 h时水解率约为84%。在现有脂肪酶的基因改造方面，主要是针对天然脂肪酶的表达量少、酶活低等缺陷进行基因改造，如对米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶基因克隆及在不同微生物中表达等方面进行研究[3-5]。研究显示，相比于具有良好活性的Palatase 20000L脂肪酶，重组脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)对大豆油水解显示出更高的活性，并进一步考察了反应参数对rProROL肪肪酶催化大豆油水解的影响，显示出该酶催化大豆油水解反应的潜在应用[6]。TAG水解率是酶促油脂水解过程的关键参数，与反应底物的转化效率以及产品的最终得率直接相关，因此，研究水解率变化规律，对酶催化反应过程进行动态预测，了解酶催化的反应机制，为提高酶催化效率将具有十分重要的指导意义。然而，对rProROL脂肪酶催化过程中底物的变化规律预测模型尚未见文献报道。本课题组前期探索了酶法催化合成乳酸正丁酯过程中酯化率经验预测模型的建立[7]，该模型可有效预测反应过程中乳酸酯化率的变化。该工作可为本研究的rProROL脂肪酶催化过程底物的变化规律预测模型的建立提供了较好借鉴，可根据本研究反应过程因素和实验结果对模型进行调整，以期更好反映rProROL酶促反应过程的变化规律。

在rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应的前期研究[8]中，我们从反应机理上推导rProROL酶催化大豆油水解反应的半经验动力学模型，该反应近似等同于一级反应动力学。本文将从纯经验处理方式出发，建立rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中预测TAG水解率的新模型，皆在于从多角度阐释rProROL催化大豆油水解过程中的反应物的变化规律。因此，本文以rProROL脂肪酶催化大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反应为研究对象，以TAG水解率为指标，考察不同反应因素对rProROL脂肪酶促大豆油水解反应过程中TAG水解率的影响。基于相关实验数据，建立一种能预测TAG水解率的新模型，为rProROL脂肪酶应用于油脂水解生产脂肪酸的工艺优化控制提供理论依据和参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

rProROL脂肪酶[Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列与成熟肽基因序列(ProROL)在重组Pichiapastoris中表达，酶粉，酶活力为5 480 U/g]：实验室自制[6]；大豆油：嘉里粮油(深圳)有限公司；甘油酯标准品(甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)：Sigma-Aldrich公司；正己烷和异丙醇：色谱纯，天津科密欧药品公司。

1.2实验方法

1.2.1酶促大豆油水解反应

固定底物(大豆油)质量为10 g并置于50 mL具塞锥形瓶中，添加一定质量的缓冲液(0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4)并充分混匀，在反应温度下预热后加入适量rProROL脂肪酶，置于一定温度的水浴振荡器(转速为200 r/min)中反应。考察反应温度(30～50 ℃)、缓冲液pH(5～7)、缓冲液添加量(5%～30%，占大豆油质量)和酶添加量(10～50 U/g)对大豆油水解率的影响。在反应过程中定时取样，样品经离心(10 000×g，5 min)后，上层(油层)将用于高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。

1.2.2水解产物的HPLC分析

样品处理：取20 μL油相(见1.2.1)于1.5 mL色谱瓶中，用1 mL流动相溶解并充分混匀，待HPLC分析。

HPLC分析的主要条件：高效液相色谱仪，Waters 1525型；示差检测器，Waters 2414型；色谱柱，Phenomenex Luna Silica(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm particle size)；柱温，35 ℃；流动相，正己烷∶异丙醇∶甲酸(15∶1∶0.003，体积比)；流速，1.0 mL/min；进样量，10 μL。通过对比标准样品的保留时间来确定酶促大豆油水解反应中各组分的出峰位置；大豆油(TAG)相对含量(质量分数，占总脂质的面积百分比)通过面积归一化法计算，结果采用平均值±标准差表示。大豆油TAG的水解率(hydrolysis rate, 简记为Hr)由公式(1)计算：

(1)

式中：TAGi，反应初始时大豆油TAG相对含量，%；TAGt，反应一段时间后混合物中TAG相对含量，%。

1.2.3数据统计分析

采用Excel 2010对TAG水解率进行处理；以TAG水解率指标进行反应过程分析，采用偏最小二乘法(Solver, Microsoft Excel 2010)拟合得到数学预测模型的参数。

2　结果与讨论

2.1反应温度对TAG水解率的影响

图1反映了反应温度对rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率的影响。从图1中可知，在相同反应时间，合适反应温度(30～45 ℃)对TAG水解率的影响不大；反应在较高温度(T=50 ℃)时TAG水解率略有下降。因此，在合理反应温度范围(30～50 ℃)内的TAG水解率数学预测模型方程中可以不考虑温度因素对其的影响。

图1　反应温度对TAG水解率的影响Fig.1　Effect of reaction temperature on the TAG hydrolysis rate

2.2缓冲液pH与TAG水解率的关系

图2所示为不同pH缓冲液对rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率的影响。

图2　pH值对TAG水解率的影响Fig.2　Effect of buffer pH on the TAG hydrolysis rate

从图2中可看出，在给定的酶添加量、反应温度和缓冲溶液添加量情况下，TAG水解率在同一反应时间下随着缓冲液pH的增大而呈现先增大后减少的趋势，而且在不同的反应时间均呈现类似的规律。当缓冲液pH值为6.5时，在考察的反应时间范围内TAG水解率较高。通过对TAG水解率随着缓冲液pH值的实验数据进行数学拟合，结果发现TAG水解率与缓冲液pH表现一种良好的数学关系，可表示为：

(2)

式中：Hr,TAG水解率，%；V,缓冲液pH值，%；a,系数；b,系数。

2.3反应时间和缓冲液添加量与TAG水解率的关系

图3反映了反应时间对rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率的影响。从图3中可知，在不同缓冲液添加量的情况下，TAG水解率随着反应时间逐渐增大，而且，两者呈现一种对数关系。由于反应时间为零时采用直接的对数函数[Ln(x)]在数学上没有意义，所以选用Ln(x+1)作为自变量，对TAG水解率随着反应时间变化的实验数据进行拟合求解。结果表明，当x=d×t时，TAG水解率与Ln(x+1)呈现良好的线性关系。因此，rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应过程中TAG水解率随缓冲液添加量的关系可表示如方程(3)所示。

Hr=c×Ln(d×t+1)

(3)

式中：Hr，TAG水解率，%；t，反应时间，h；c，系数；d，系数。

图3　反应时间对TAG水解率的影响Fig.3　Effect of reaction time on the TAG hydrolysis rate

图4反映了rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率随着缓冲液添加量(W)的变化规律。从图4a中可知，随着缓冲液添加量的增加，TAG水解率逐渐增大；对TAG水解率随着缓冲液添加量变化的实验数据进行拟合求解，结果发现TAG水解率与缓冲液添加量呈现一种指数关系。结果表明，TAG水解率与W0.085呈现很好的线性关系(见图4b)。据此，rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率随着缓冲液添加量的变化关系可用方程(4)表示。

Hr=e×W0.085

(4)

式中：Hr,TAG水解率，%；W,缓冲液添加量，%；e,系数。

图4　酶促反应过程中TAG水解率随缓冲液添加量的变化规律Fig.4　Effect of the amount of buffer on the TAG hydrolysis rate

2.4酶添加量与TAG水解率的关系

图5反映了rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中TAG水解率随着酶添加量(D)的变化规律。从图5a中可知，随着酶添加量的增大，TAG水解率逐渐增加。对TAG水解率随着酶添加量变化的实验数据进行拟合求解，结果发现在不同的反应时间下两者呈现一种指数关系，以D0.095为横坐标与TAG水解率为纵坐标作图，可以发现两者之间也呈现出较好的线性关系(如图5b所示)，因此，TAG水解率与酶添加量之间的关系可用方程(5)表示：

Hr=f×D0.095

(5)

式中：Hr,TAG水解率，%；D,酶添加量，U/g；f,系数。

2.5TAG水解率预测的数学经验模型建立与验证

根据上述方程(1)～(5)确立了缓冲液pH、缓冲液添加量、反应时间与酶添加量与TAG水解率的数学关系。根据方程(1)～(5)和数学变换法则，由此可得到基于本研究考察反应参数下大豆油在rProROL脂肪酶催化作用下TAG水解率与反应因素的总关系式，可表示为：

图5　酶促反应过程中TAG水解率随酶添加量的变化规律Fig.5　Effect of lipase dosage on the TAG hydrolysis rate

(6)

式中：Hr，TAG水解率，%；D，酶添加量，U/g；t，反应时间，h；V，缓冲液pH；W，缓冲液添加量，%；g,h,i,j为方程系数。

在改变上述反应参数(即缓冲液pH及其添加量、酶添加量和反应时间)的情况下，通过不同实验条件下测得的TAG水解率，代入该方程(6)进行数值拟合，求得方程(6)中的方程系数(g=0.943 7，h=2.803，i=2.976，j=13.94)。已知该方程系数的基础上，通过方程(6)计算出TAG水解率的预测值，并与相同反应参数下的实验值比较，结果如图6所示。由图6可知，两者相近程度的曲线拟合相关系数(R2)为0.914 6，由此可知，该模型可对上述实验范围内大豆油在rProROL脂肪酶催化水解反应过程中TAG水解率变化进行很好地预测。

图6　TAG水解率的实验测定值与模型拟合值之间的比较Fig.6　Comparative result of conversion between experimental determined and model predicted data

3　结论

本文研究确定了rProROL脂肪酶催大豆油水解的适宜温度为45℃后，系统地考察脂肪酶催化反应过程中的缓冲液pH及其添加量、反应时间和酶添加量对TAG水解率的影响，建立了该酶促水解反应过程中TAG水解率变化规律经验模型。通过比较TAG水解率的实验测定值和模型预测值后发现，两者的相关系数(R2)为0.914 6，说明该模型可很好地预测rProROL脂肪酶催大豆油水解反应过程中TAG水解率的变化。

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[8]覃小丽, 李道明, 王永华，等. rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应的半经验动力学模型[J]. 食品与发酵工业, 2016,42(6)：67-72.

New model for the predication of hydrolysis rate during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by recombinantRhizopusoryzaelipase

QIN Xiao-li1,LI Dao-ming2, WANG Yong-hua2, ZHONG Jin-feng1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effects of parameters (reaction temperature, buffer pH, buffer amount and lipase amount) on the triglyceride (TAG) hydrolysis rate during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by a recombinantRhizopusoryzaelipase containing prosequence (rProROL) were analyzed, and the empirical model of TAG hydrolysis rate was built based on the integration of a series of parameters including buffer pH, buffer amount and lipase amount. The results showed that the correlation coefficient between TAG hydrolysis rates obtained from experiments and predicted by the established model was 0.9146, confirming that this model could precisely predict TAG hydrolysis rate. Therefore, the model could be applied to the practical hydrolysis process catalyzed by rProROL for optimizing and monitoring TAG hydrolysis rate.

recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence (rProROLT1 lipase); hydrolysis; empirical model; hydrolysis rate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608011

博士，讲师(钟金锋副教授为通讯作者，E-mail：jinfzhong@163.com)。

中央高校基本科研业务费专项(XDJK2014B019)；重庆市基础科学与前沿技术研究专项(cstc2015jcyjA80013)；国家自然科学基金(31501446)

2016-03-28, 改回日期：2016-04-13