抗菌实验操作细节对测试效果的影响

张倩，陈晓洁，王璐，劳继红

东华大学纺织面料技术教育部重点实验室 纺织学院 (上海，201620)



抗菌实验操作细节对测试效果的影响

张倩，陈晓洁，王璐，劳继红

东华大学纺织面料技术教育部重点实验室 纺织学院 (上海，201620)

分别比较了几种常用细菌接种方法对测试效果的影响； 不同含菌琼脂平板的制作方法以及不同培养基体积对抑菌圈大小的影响。结果表明： 接种方法对菌落计数结果有一定的影响； 含菌琼脂平板的制作方法以及培养基体积与抑菌圈大小具有一定的相关性。

抗菌实验； 操作细节； 抑菌圈

0　引言

日常生活中， 不可避免地会接触到各种各样的细菌、 真菌等微生物。这些微生物在一定条件下会大量繁殖， 并传播疾病， 影响人们的健康。随着生活水平和工业水平的提高， 市场上出现了各种各样的抗菌材料及其产品， 但产品质量参差不齐[1]。如何准确地检测这些产品的抗菌性， 对于抗菌产品的良性发展格外重要。

目前国内外涉及抗菌材料及其产品的相关测试标准很多， 涉及纺织、 化学、 材料、 卫生等领域。纺织品最容易受微生物侵蚀， 国内外很早就开始了对纺织品抗菌的研究， 各国先后推出了一系列抗菌标准， 后来又推出了国际标准， 可见抗菌纺织品的研究走在抗菌材料评价的前沿[2]。但是各国的标准各不相同， 即使依据同一测试标准， 在同一实验条件下， 各实验室间的测试结果还是会存在一定的差异[3]。这些差异可能是很多因素引起的， 如接种菌液的浓度与活性、 操作细节、 培养基水平等[4-5]。

本文参照纺织品抗菌测试标准就抗菌实验过程中的操作细节对其测试效果的影响进行了讨论。

1　实验部分

1.1实验材料及仪器

1.1.1实验材料

氯化钠(上海凌峰化学试剂有限公司)， 胰蛋白胨、 酵母提取物、 琼脂(英国Oxide公司)， 氢氧化钠(上海化学试剂有限公司)， 大肠杆菌EscherichiaColi(E.coli， ATCC 25922)， 金黄色葡萄球菌StaphylococcusAureus(S.aureus， ATCC 25923)(江苏省博达生物卫生技术有限公司)， 抗菌滤纸片。

1.1.2实验仪器

MLS-3750高压蒸汽灭菌锅(Tega SANYO Industry Co., Ltd)， TS-100C恒温摇床(上海柏欣仪器设备厂)， GHP-9080隔水式恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)， SW-CJ-1FD洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)， DL91150数显游标卡尺(得力工具(余姚)有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1实验前灭菌准备

抗菌实验过程中所用到的试管、 锥形瓶、 量筒、 培养皿等在使用前需要经过灭菌处理。具体操作方法如下： 将需要的器皿洗净， 干燥后包好放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理， 灭菌完成后取出， 冷却干燥。

1.2.2培养基的准备

(1)按照表1配方配置培养基

表1　培养基的配方　　(g)Tab.1　Culture medium formulations

(2)按上述配方称好试剂后， 加蒸馏水定容至250 mL， 搅拌至完全溶解。然后向其中加入50 μL 5 mol/L的氢氧化钠溶液， 调节pH为7.2±0.2。

(3)将配好的TSA、 TSB放入高压灭菌器中进行灭菌。

1.2.3 菌液的准备

(1)获取菌落： 用无菌接种环沾取细菌， 在无菌琼脂平板表面进行平板划线， 细菌数量随着划线次数的增加而减少， 并逐渐分散开来， 然后置于37 ℃的恒温培养箱中进行培养， 可在平板表面得到单个菌落。

(2)菌种的转接： 挑取平板上的单个菌落， 置于4 mL的TSB中， 在37 ℃、 转速为180 r/min的恒温摇床中振荡培养12～14 h。

(3) 扩大培养： 取3 mL培养后菌液于50 mL TSB中， 在37 ℃、 转速为173 r/min的恒温摇床中继续振荡培养2.5 h。

1.2.4 细菌的接种[6-7]

细菌的接种方法有很多。本文对实验室常用的接种方法进行了比较， 具体接种方法见表2。

表2　细菌的接种方法Tab.2　Bacterial inoculation methods

1.2.5含菌琼脂平板的制备[8-11]

平板培养基法是典型的定性抗菌测试方法， 是通过抗菌剂在平板上扩散形成抑菌圈来评价产品抗菌性的。各国的纺织品抗菌测试标准中均有此法， 但是各标准和实验室对含菌琼脂平板的制作方法存在一定的差异， 本文就几种常用的制作方法进行了比较， 具体操作方法见表3。

表3　含菌琼脂平板的制作方法Tab.3　Production methods of ager plate containing bacterial

由于方法4将培养基分为两层， 容易导致接种菌液在琼脂平皿上分布不均匀， 所以本文主要针对前三种方法进行讨论。

2　结果与分析2.1　细菌接种方法的比较

分别用1.2.4所述的三种接种方法测试了同一菌液的活菌浓度， 测试菌种为金黄色葡萄球菌， TSA用量为15 mL， 菌落形态如图1所示， 测试结果如图2所示。

图1　接种方法对菌落形态的影响Fig.1　Influence of inoculation methods on the colonial morphology

图2　不同接种方法的测试结果比较Fig.2　Comparison of the test results of different inoculation methods

由图1可以看出， 倾注法的菌落不完全分布在培养基表面， 对菌落形态的观察带来不便； 而涂布法与滴注法的菌落长在培养基表面， 便于观察菌落形态。采用SPSS对测试结果进行了统计分析， 结果如图2所示， 倾注法与涂布法的结果存在显著性差异、 与滴注法的结果存在非常显著的差异， 涂布法与滴注法的结果不存在显著性差异。这可能是由于采用倾注法会影响细节与氧气的接触， 琼脂培养基温度也会对测试结果造成影响。抗菌实验时， 操作人员应选择合适的接种方法进行实验。

2.2含菌琼脂平板的制作方法对抑菌圈的影响

按照1.2.5所述的三种方法制作含菌琼脂平板， 所用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液浓度为1×108～5×108cfu/mL， TSA用量为15 mL， 其中方法1和方法2所用菌液量为1 mL， 比较了含菌琼脂平板的制作方法对抑菌圈大小的影响， 两种菌的测试结果如图3所示。

图3　含菌琼脂平板制作方式对抑菌圈大小的影响Fig.3　Influence of production methods of ager plate containing bacterial on the size of the inhibition zone

由图3可知， 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌， 方法1和方法2的结果不存在明显差异， 而均与方法3存在显著性差异。原因可能是方法1和方法2只是操作方法上的略微差异， 菌液量相同， 而方法3由于采用的是棉签蘸取菌液， 菌液量无法定量控制， 得出的结果差异也就较大。实验时还发现方法1和方法2菌液在平板上分布比较均匀， 方法3由于使用棉签涂抹， 均匀性不如前两种方法好。

2.3培养基体积对抑菌圈的影响

虽然标准中对培养基体积有规定， 但很多实验人员在实验时并未严格按照标准所述规定， 而是根据经验进行操作[11]。按照1.2.5中所述的方法1制作含菌琼脂平板。向平板中加入1 mL浓度为1×108～5×108cfu/mL的菌液， 然后加入不同体积的培养基。培养基体积对抑菌圈大小的影响的结果如图4所示。

图4　培养基体积对抑菌圈大小的影响Fig.4　Influence of the volume of ager medium on the size of the inhibition zone

由图4可知， 随着培养基体积的增加， 抑菌圈宽度逐渐减小。10 mL与15 mL结果间不存在显著差异， 20 mL与25 mL结果间也不存在显著性差异， 但是10 mL、 15 mL与20 mL、 25 mL之间却存在非常显著的差异。出现这一现象的原因可能是由于随着培养基体积的改变， 厚度和含氧量都随之变化。培养基体积越大， 厚度越大， 渗透到培养基底部的抗菌剂可能就越多， 从而表面的抗菌剂就较少， 抑菌圈也就较小。实验人员进行抗菌实验操作时应保证所用的培养基体积一致。

3　结论

本研究结果显示细菌接种方式对实验测试效果有一定的影响； 含菌琼脂平板的制作方法会影响抗菌定性测试抑菌圈的大小， 操作时应保证平板上的菌液量一致， 避免人为因素对实验结果的影响； 培养基体积的多少与抑菌圈大小有一定的相关性， 随着培养基体积的增加， 抑菌圈宽度反而减小， 实验时应保证所用培养基体积的一致。

[1] 孙杰, 于伟东. 纺织品抗菌测试方法和影响因素分析[J]. 现代纺织技术, 2014(2): 38-41.

[2] 季君晖, 史维明. 抗菌材料[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003.

[3] 蒋洁蓉, 杨瑶, 王田田, 等. 纺织品抗菌性能测试中试验菌活性确定的研究[J]. 丝绸, 2015, 52(3): 26-30.

[4] 赵雪, 展义臻. 抗菌纺织品的性能测试方法[J]. 上海毛麻科技, 2009(1): 31-36.

[5] 赵晓伟. 纺织品抗菌性能的测试标准[J]. 印染, 2013(15): 36-39.

[6] GB/T 20944.2-2007纺织品抗菌性能的评价-第2部分: 吸收法[S].

[7] 刘碧源, 高仕瑛, 李邦良, 等. 壳寡糖抗菌活性的实验研究[J]. 中国生化药物杂志, 2003, 24(2): 73-75.

[8] JIS L 1902:2008 Testing for antibacterial activity and efficacy on textile products[S].

[9] AATCC 90-2011 Antibacterial Activity Assessment of Textile Materials: Agar Plate Method[S].

[10] GB/T 20944.1-2007 纺织品抗菌性能的评价-第1部分: 琼脂平皿扩散法[S].

[11] 吴剑云,罗利玲.培养基体积对抗菌纺织品抑菌圈的影响分析[J].中国纤检,2012: 72-73.

Influence of Operation Details on the Results of Antibacterial Experiment

ZHANG Qian, CHEN Xiaojie, WANG Lu, LAO Jihong

Key Laboratory of Textile Science and Technology, Ministry of Education,College of Textiles, Donghua University (Shanghai, 201620)

The influence of different bacterial inoculation methods on the results of antibacterial experiment was compared. The effects of different fabrication methods of ager plate containing bacterial and different volume of ager medium on the size of the inhibition zone was studied. Results showed that different bacterial inoculation methods had impacts on the results of antibacterial experiment. The fabrication methods of ager plate containing bacterial and the volume of ager medium had a certain correlation with the size of the inhibition zone.

antibacterial experiment, operation details, the inhibition zone

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.01.002

高等学校学科创新111计划(B07024)

张倩，硕士，研究方向：抗菌纺织材料,

E-mail: zh901026@163.com

王璐，教授，博导，E-mail:wanglu@dhu.edu.cn

TS 101.4

A

1674-1242(2016)01-0006-04

-2015-10-14)