新疆特色药食同源植物恰玛古内生细菌的分离与筛选

赵燃，迪丽达尔·库德热提，姚粟，苗蕾，梁寒峭，刘素辉，曹艳花，陈建国，刘洋*，孙玉萍*

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100027)2(新疆医科大学，基础医学院微生物学教研室，新疆 乌鲁木齐，830011)3(新疆医科大学，公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐，830011)



新疆特色药食同源植物恰玛古内生细菌的分离与筛选

赵燃1，迪丽达尔·库德热提2，姚粟1，苗蕾3，梁寒峭1，刘素辉2，曹艳花1，陈建国1，刘洋1*，孙玉萍2*

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100027)2(新疆医科大学，基础医学院微生物学教研室，新疆 乌鲁木齐，830011)3(新疆医科大学，公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐，830011)

通过传统微生物培养方法对我国新疆恰玛古内生细菌进行分离及筛选，共得到48株内生细菌，分为7个OTUs，经形态学观察、16S rDNA扩增及系统发育分析，将其归为厚壁菌门(Firmicutes)中的芽胞杆菌属(Bacillussp.)、放线菌门(Actinobacteria)中的微杆菌属(Microbacteriumsp.)和变形菌门(Proteobacteria)中的噬脯氨酸菌属(Prolinoborussp.)。这是国内外首次对我国新疆特有的药用植物恰玛古内生细菌进行分离筛选的研究。

新疆恰玛古；内生细菌；培养方法

植物内生菌是指一类微生物，它们的生活史中部分或全部阶段在健康植物中定殖，并且不会对植物的细胞及组织造成危害。植物内生菌定植在宿主植物中，内生菌与其宿主在协同进化的过程中形成了互利共生的关系。内生菌生长所必需的碳源氮源等多种营养物质由宿主植物光合作用来提供；同时，内生菌在生长代谢过程中会产生促进植物生长、抵抗病原菌、提高植物抗逆性，间接起到植物促生作用的活性物质[1]。

非培养方法能够反映植物内生菌的多样性及群落分布结构特点，具有客观、全面等特点[2-3]。然而，培养方法作为传统的植物内生菌研究手段，也有其特有的优点，它以微生物的纯培养法为基础，对微生物进行分离、筛选和纯化，进而对筛选到的菌株进行分类学鉴定，通过该方法能够了解植物内的可培养微生物的生长情况，尤其是在特定生长条件下的生存状况，另一方面通过对可培养微生物的分离筛选，可以获得微生物新种和一些具有潜在应用价值的菌种资源[2]。

恰玛古(BrassicarapaL.)又名芜菁或蔓菁，恰玛古是其维吾尔文名称，在我国新疆南部地区大面积种植，具有一定药用作用，尤其是其根部，是新疆维吾尔等少数民族日常喜食的植物[4]。目前关于恰玛古的研究大多着重于化学成分的角度，对其内生细菌的研究还鲜有报道，本文采用传统微生物培养方法对恰玛古内生细菌进行了分离及筛选，为进一步研究其内生细菌与恰玛古之间的相互作用关系，揭示恰玛古在长寿作用方面的疗效奠定了基础。

1　材料与方法

1.1植物样品

恰玛古成熟果实，于2015年9月15日采集自中国新疆乌鲁木齐市米东区古牧地镇团结村十一小队，具体位置为北纬87.69°，东经44.02°，样品于4 ℃保存。

1.2培养基及试剂

成品培养基LB、R2A及TSA购自北京陆桥公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；PCR引物由北京诺赛生物公司合成； PCR相关试剂购自TIANGEN公司。

1.3样品表面灭菌

恰玛古果实用无菌水将表面泥土清洗干净，并用无菌水冲洗，采用刘洋等[5]的方法对恰玛古果实进行表面灭菌；表面灭菌效果检测方法为取最后一次淋洗水120 μL，涂于LB固体培养基平板上，28 ℃培养72 h，观察有无菌落形成[5]。用无菌手术刀及镊子切取5 g已表面灭菌的恰玛古样品内部组织块，置于无菌研钵中。

1.4内生细菌的分离与纯化

对恰玛古内生菌进行分离培养及纯化，具体参考刘琳等方法[2]。根据平板上长出的菌落形态(大小、形状、颜色、透明度、湿润度、表面光泽度、边缘整齐度等)，记录菌落形态的基本特征，同时随机挑取菌落形态不同的代表性菌落，用对应培养基对其进行分离纯化，保证每个菌落为单菌落，再接种于斜面培养基4℃保存备用。

1.5内生细菌的16S rDNA序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取菌株基因组DNA。引物选取细菌通用27F和1492R[6]， 以细菌基因组DNA作为PCR反应的模板，对菌株16S rDNA片段进行PCR扩增。PCR反应条件参见刘洋等方法[5]。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。采用ABI 3730型DNA测序仪测序(ABI，USA)，将序列信息提交至NCBI，并将测序所得结果在EzTaxon server 2.1进行比对[7]，确定得到序列与已知序列的同源关系。

2　结果与分析

2.1恰玛古种子内生细菌的分离纯化

通过传统微生物分离培养共获得恰玛古内生细菌48株，根据这些菌株较为明显的形态差异分为5类，其菌落及菌体形态特征如表1所示。

表1　恰玛古内生细菌及其形态特征

2.2恰玛古内生细菌基因组DNA提取及16S rDNA片段PCR扩增

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取恰玛古内生细菌基因组DNA，并以其为模板，对16S rDNA片段进行PCR扩增， 1%凝胶电泳显示PCR产物条带单一且明亮，大小约为1 500 bp(见图1)。

M-D2000 Marker Ladder; 1-10: 恰玛古内生细菌16S rDNA片段图1　恰玛古内生细菌16S rDNA片段扩增结果Fig.1　The 16S rDNA agarose gel electrophoresis of endogenous bacteria from Turnip

2.3恰玛古内生细菌16S rDNA系统发育分析

恰玛古内生细菌的16S rDNA序列比对分析结果如表2所示，所得序列 GenBank登录号为KT990223- KT990229。经16S rDNA序列比对及其系统发育分析(见图2)，恰玛古内生细菌包含7个OTU，分属厚壁菌门(Firmicutes)中的芽胞杆菌属(Bacillussp.)、放线菌门(Actinobacteria)中的微杆菌属(Microbacteriumsp.)和变形菌门(Proteobacteria)中的噬脯氨酸菌属(Prolinoborussp.)；该群落优势属(丰度)为Bacillus(85.4%)(表2)。

3　讨论

恰玛古(BrassicarapaL.)又称为芜菁或蔓菁，维吾尔文称其为恰玛古，其根常入药，是新疆地区少数民族喜爱食用的药食植物[4]。药典中对恰玛古的药理作用有所记载可以追溯到两千多年前，《本草纲目》等书籍中称其益中气、利五脏、解邪毒。近几年也有学者对恰玛古的药理作用有所研究，恰玛古中多糖提取后对小鼠进行血糖试验发现当剂量达到400 mg/kg时，受试小鼠血糖下降明显，这说明恰玛古具有降糖效果是其中的多糖成分在发挥作用[8]。孙艳等[9]发现恰玛古制成的蜜膏能够促进血清中抗体的生成，实验表明其作为一种免疫促进剂，能够使小鼠食用后血清中IgM抗体的水平有所提高。还有研究表明恰玛古硫代葡萄糖苷的含量很高，其降解后的产物能预防多种癌症发生[10]，恰玛古根皮中含有芸苔素成分，可以对某些病原菌及人类寄生虫产生抑制作用[11]。

本研究自我国特有的新疆药食植物恰玛古中分离培养得到48株内生细菌，包含7个OTUs，分属于芽胞杆菌属(Bacillussp.)、微杆菌属(Microbacteriumsp.)和噬脯氨酸菌属(Prolinoborussp.)，其中优势菌属为Bacillus(85.4%)，最优势菌为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，所占比例达到41.8%。芽胞杆菌由于其能够产生耐极端生境的内生孢子，因此在自然界中分布广泛。芽胞杆菌中也不乏一些植物促生菌和生防菌，如多粘芽胞杆菌(B.polymyxa)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)和枯草芽胞杆菌(B.subtilies)等。芽胞杆菌的生防作用主要通过代谢产物对病原菌起到拮抗作用，例如蜡样芽胞杆菌代谢产生的酶类物质可以降解或水解其他病原菌，从而起到生防作用[12]。同时，芽胞杆菌也能够促进植物生长，合成生长素、赤霉素等生长激素，对植物起到促生作用[13]。

表2　恰玛古内生细菌16S rDNA序列相似性分析

图2　邻接法构建的恰玛古内生细菌16S rDNA序列系统发育树Fig.2　The phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences from Turnip using the neighbour-joining(注：每个分支点处的数字为Bootstrap(1000次抽样)的支持百分率，标尺代表1%的序列差异度。)

通过以上研究可见，新疆药食植物恰玛古中存在多种细菌资源，内生细菌的群落多样性较丰富，其中富含一些有益的菌种资源。因此，通过传统培养方法对恰玛古内生细菌进行分离和鉴定，能够筛选出具有生防及植物促生作用的潜在功能性菌株，为深入研究内生菌与恰玛古植物的药理作用之间的关系奠定了基础。

4　结论

本研究是国内外首次针对我国特色新疆药食植物恰玛古，利用传统微生物培养方法分离其内生细菌，内生菌分属芽胞杆菌属、微杆菌属和噬脯氨酸菌属，其中包含潜在的生防菌及植物促生细菌，本研究为今后进一步开展恰玛古的药食作用与其内生细菌之间的相互作用关系奠定了基础。

致谢:中国食品发酵工业研究院程池教授在本研究工作中提供了指导与帮助，在此特表示感谢。

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Separation and screening of endophytic bacteria in Xinjiang Turnip (BrassicarapaL.)

ZHAO Ran1, DILIDAER Kudereti2,YAO Su1, MIAO Lei3, LIANG Han-qiao1,LIU Su-hui2, CAO Yan-hua1, CHEN Jian-guo1, LIU Yang1, SUN Yu-ping2*

1(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)2(College of Basic Medical Science, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)3(College of Public Health, Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)

The endophytic bacteria in Xinjiang Turnip were isolated, screened and identified by the microbial culture-dependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis. The result showed that the total 48 strains from Turnip were classified into 7 OTUs and belonged toBacillus,MicrobacteriumandProlinoborus. It was the first time that culture-dependent method was used to isolate and identify the endophytic bacteria in Turnip used as medicinal plants in Xinjiang.

Xinjiang Turnip;endophytic bacteria;culture-dependent method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609022

硕士研究生(刘洋,孙玉萍为通讯作者,E-mail：ly81150@163.com,544481723@qq.com)。

中国食品发酵工业研究院科技发展基金(博士基金)项目(2012KJFZ-BS-01) ；国家自然科学基金(81460153，81560153)；新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211C014)

2016-02-23,改回日期：2016-04-13