冷藏条件下缢蛏、文蛤ATP关联产物的变化及降解途径的探究

王丹妮，邱伟强，陈舜胜，宋雪

(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)



冷藏条件下缢蛏、文蛤ATP关联产物的变化及降解途径的探究

王丹妮，邱伟强，陈舜胜*，宋雪

(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)

为了研究冷藏条件下，缢蛏、文蛤三磷酸腺苷(ATP)及关联产物的变化和降解途径。采用高效液相色谱法对贮藏在4 ℃下的缢蛏和文蛤的9种ATP关联物进行测定，分别为：三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)，二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate，ADP)，单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，肌苷酸(inosine monphosphate，IMP)，腺嘌呤核苷(adenosine，AdR)，次黄嘌呤核苷(inosine，HxR)，次黄嘌呤(hypoxanthine，Hx)，黄嘌呤(xanthine，Xt)和腺嘌呤(adenine，Ad)。研究发现，在4 ℃下，从缢蛏和文蛤中检测到的产物都为ATP、ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt，未测到Ad。 ATP的初始值分别为1.033和0.824 μmol/g，试验前4 d下降较快，之后缓慢下降；ADP呈下降趋势；AMP、IMP、AdR和HxR含量先上升后下降；Xt呈上升趋势；缢蛏中Hx呈上升趋势，文蛤则先上升后下降。根据ATP关联物的变化，推测2种贝类的代谢途径为ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt，因文蛤中IMP含量极少，所以推测文蛤以第2条途径为主。结合感官评价和TVB-N实验发现，2种贝类的Kax值与感官评分和TVB-N均存在显著相关性，Kax值可用于2种贝类的鲜度评价。

缢蛏；文蛤；ATP关联产物；降解途径；高效液相色谱

缢蛏(Sinonovaculaconstricta)，和文蛤(Meretrixmeretrix)分别属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、帘蛤目(Veneroida)中的竹蛏科(Solenidae)和帘蛤科(Veneridae)[1-2]。作为我国重要的海产双壳类，2014年我国蛏类、蛤类分别占贝类总产量的5.9%和29.5%[3]。目前贝类以鲜销为主，加工业还很薄弱，由于收获季集中，采捕期短，保鲜保活不当时，会造成变质，带来巨大损失[4]。为了更有效地利用贝类，客观评价其鲜度就显得尤为重要。K值是将核苷酸的分解代谢产物作为鲜度指标的一种评价方法[5]，广泛应用于鱼类。由于人们对贝类核苷酸的分解途径和产物仍存在争议，普遍认为鱼类和贝类核苷酸的分解途径和产物不同，所以K值是否能够客观评价贝类鲜度，仍有待探究。近年来，对扇贝、牡蛎等贝类的ATP及关联产物变化和降解途径的研究较多，而缢蛏和文蛤研究较少，探究缢蛏和文蛤核苷酸的降解途径有利于深入了解双壳贝类核苷酸分解变化过程，为以后探究其他贝类的核苷酸降解途径提供一种方法，并对贝类的加工利用带来一定的指导。

本试验采用高效液相色谱法，以缢蛏和文蛤为试验对象，测定4 ℃贮藏期间，2种贝类ATP及关联产物的变化，推测其降解途径，并探究其适用于评价2种贝类鲜度K值的可行性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

缢蛏、文蛤，购买于上海古棕路水产品批发市场，均为新鲜健康活体(缢蛏长：5.5～6.7 cm，宽：1.7～2.2 cm；文蛤长：3.5～4.2 cm，宽：2.5～2.7 cm)，在盐度为2.7%的盐水中吐沙24 h，蒸馏水清洗，然后快速去半壳，杀死，2只作为一个样本，取3个平行，装入PE袋，置于4 ℃冰箱中待处理。

甲醇(色谱纯)，德国Merck公司；KH2PO4、K2HPO4(色谱纯)，上海安谱实验科技股份有限公司；H3PO4、NaOH、高氯酸(优级纯)，上海国药集团；ATP、ADP、AMP、IMP、GMP、HxR、AdR、Hx、Xt、Ad标准品(纯度≥99%)，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱系统，美国Waters有限公司；KUBOTA 520离心机，日本岛津有限公司； 酸度计(pH计)，瑞士METTLER TOLEDO公司；H-2050R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；全自动凯氏定氮仪KJELTEC 8400，瑞典FOSS公司。

1.3实验方法

1.3.1标准溶液配制

分别称取10种标准品0.1 g于烧杯中，充分溶解，超纯水定容至50 mL容量瓶中，并依次稀释得到100，50、25、10和5 μg/mL的混合标准溶液梯度。

1.3.2样品处理

从第0天(新鲜状态)到第12天，每天取4 ℃贮藏条件下的缢蛏和文蛤约3 g，于冰浴条件下剪碎(每个样品3个平行)，加入10% PCA 15 mL，研磨捣碎，然后5 000 r/min离心10 min，将上清液转移至烧杯中，置于4 ℃下，将所得沉淀物加入5% PCA 10 mL，研磨捣碎，5 000 r/min离心10 min，合并上清液，用2 mol/L KOH和H3PO4调节pH值至5.7，静置于4 ℃下，然后超纯水定容至50 mL容量瓶中。取样品溶液2 mL过0.22 μm滤膜于进样瓶中，待高效液相仪器(HPLC)分析。

1.3.3色谱条件

参照邱伟强等[6]的方法并稍作修改。色谱柱：岛津ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相A：15 mmol/L KH2PO4和15 mmol/L K2HPO4(体积比1∶1)溶液，流动相B：纯甲醇溶液；缓冲液pH值：5.7；流速：1 mL/min；进样量10 μL；检测波长254 nm；测定时间35 min；梯度洗脱方法： 0～8 min，流动相A为100%； 8～10 min，流动相B线性增加至3%； 10～15 min，流动相B线性增加至6%； 15～23 min，流动相B线性增加至15%； 23～28 min，流动相B线性增加至30%； 28～30 min， 流动相A回到初始梯度状态100%。

1.3.4感官评定实验

试验筛选8名感官评定人员，制定感官评价表(表1)。评定标准：最高为5分，最低为0分，设置外观、气味、肉质的权重分别为0.4，0.3和0.3。每个指标的平均分乘以权重，然后相加之和为感官评分[7-9]。评分越高，鲜度越好。5～4分为新鲜可食，4～3分为可接受，3～0为不可接受。

表1　双壳贝类感官评价表

1.3.5挥发性盐基氮的测定

按SC / T3032—2007[10]规定的方法测定。

1.3.6ATP关联产物含量计算

用EXCLE2010，origin，SPSS等软件进行统计。高效液相测得ATP及其代谢产物的面积，通过标准品线性关系计算得出相应的浓度值cm，用式(1)分别计算出待测样品中9种ATP关联产物的含量。

(1)

式中：x，待测样品中9种ATP关联产物的含量，μmol/g；cm，标准品线性关系计算得到的相应的浓度值，μg/mL；mx，待测样品的总质量，g；Mx，9种ATP关联物的摩尔质量，g/mol。

2　结果与分析

2.1高效液相色谱法测定ATP及关联物标准品

试验采用反相液相色谱法，为了排除2种贝类在试验过程中可能产生GMP，造成干扰[6]，在9种ATP关联产物标准品中加入GMP标准品。1.3.3色谱条件下，以标准品混合溶液作为检测对象，对浓度梯度为5，10、25、50、100和200 μg/mL的混合标准溶液进行测定，每个梯度进样3次，以保留时间作为定性依据，绘制10种标准品浓度与峰面积的标准曲线。

图1　9种ATP关联物及GMP标准品(100 μg/mL)的高效液相色谱图Fig.1　Chromatogram of the standard solution of 9 ATP-related compounds and GMP(100 μg/mL)

2.2缢蛏、文蛤体内ATP及关联产物的变化及分解途径

2.2.1ATP及关联产物的含量变化

缢蛏和文蛤在鲜活状态下立即杀死，最初ATP的含量分别为1.033 μmol/g和0.824 μmol/g。于4 ℃下贮藏3 d，ATP快速下降，第3天缢蛏和文蛤ATP分别下降至0.205 μmol/g和0.172 μmol/g，比鲜活状态时分别下降了80%和79%，下降幅度较大，如图2，图3所示。

图2　在4 ℃下缢蛏贮藏期间ATP关联物含量变化Fig.2　Changes in contents of ATP-related compounds in Sinonovacula constricta during storage at 4 ℃

图3　在4 ℃下文蛤贮藏期间ATP关联物含量变化Fig.3　Changes in contents of ATP-related compounds in Meretrix meretrix during storage at 4 ℃

这种现象与鱼类ATP降解现象相似，刘寿春等[11]在冷藏罗非鱼片中发现，ATP含量在前2 d下降了近80%。ATP快速下降的原因，可能因为贝类体内三磷酸腺苷酶活性较强，WATABE等[12]认为在死后的最初阶段，因为肌细胞中Ca2+对肌浆网的吸附能力下降，导致其大量进入细胞液中，肌原纤维中的Ca2+的浓度增加，使得肌原纤维ATP酶被激活，从而引起ATP快速下降。初始ADP含量分别为1.074，0.694 μmol/g，呈下降趋势。

2种贝类，初始AMP含量较少，缢蛏为0.563 μmol/g，文蛤为0.552 μmol/g，表现为先上升后下降的趋势。缢蛏中有蓄积现象，在贮藏第5天达到最大值1.627 μmol/g，文蛤在第2天达到最大值1.250 μmol/g，随后快速下降。汤水粉[13]在研究真鲷(Pagrosomusmajor)、鰤鱼(Seriolaquinqueradiata)、红甘鱼(Kanpachi)、鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)和草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的ATP关联物变化时，发现ATP转变成IMP的过程十分迅速，AMP含量没有显著增加且含量较低，这与2种贝类检测到的结果不同，WANG等[14]在牡蛎(Ostreagigasthunberg)的闭壳肌，外套膜、鳃和其余部位中发现了与2种贝类相同的现象，这可能是贝类区别于鱼类的特性。缢蛏在贮藏第4天检测到IMP，含量为0.081 μmol/g，之后先上升后下降，最大值为0.133 μmol/g，于第12天消失。在第3天测到AdR，初始值0.067 μmol/g，呈先上升后下降趋势，最大值为0.165 μmol/g，在第10天消失；IMP的含量与AdR相近。文蛤中只检测到了极少量的IMP，AdR先上升后下降，最大值为0.624 μmol/g，远高于缢蛏(图2、图3)。这说明2种贝类中同时存在IMP和AdR2种分解产物，因种类不同而导致含量不同，但变化趋势相同。AMP和IMP不仅是ATP降解过程的中间产物，还具有重要的呈味作用，与鱼类主要以IMP呈味不同，缢蛏和文蛤中IMP含量较少，AMP含量较高，因此核苷酸与谷氨酸和天门冬氨酸相乘产生的鲜味效果，为贝类主要鲜味来源[15]。

贮藏期间，缢蛏HxR含量较高，于第2天出现，第12天消失，先上升后下降。在第6天，当IMP和AdR缓慢下降时，HxR仍持续上升至第9天，说明HxR的合成速率大于HxR的分解速率，最大值为0.682 μmol/g。文蛤不同于缢蛏，仅在第6到第9天检测到HxR，最大值为0.262 μmol/g，但Hx含量高，说明HxR快速分解为Hx。2种贝肉中HxR合成与分解速率不同，可能与贝肉中酶的活性相关。由于贝类初菌数较高，滩涂养殖的缢蛏和文蛤菌落总数均可达105CFU/g[16]，一些低温菌在冷藏条件下十分活跃，造成了后期HxR快速下降。缢蛏体内在第6天检测到Hx，Hx呈直线上升趋势，文蛤第2天检测到Hx，呈先上升后下降趋势。Xt由黄嘌呤氧化酶作用于Hx产生，随着贮藏时间的增加，2种贝类体内的Xt含量都不断上升。

2.2.2两种双壳贝类核苷酸分解途径探究

一般来说，核苷酸分解前期ATP→ADP→AMP的过程是相同的。而AMP因物种不同，而分解成不同的产物，已知的有3条途径：AMP→IMP→HxR，AMP→AdR→HxR，AMP→AdR→Ad[16-17]。鱼类中，通常核苷酸的降解途径为AMP→IMP→HxR→Hx[18]；虾中，邱伟强等[6]推测斑节对虾(Penaeusmonodon)和罗氏沼虾(Macrobrachuimrosenbergii)核苷酸的降解途径为AMP→IMP→HxR(1%)和AMP→AdR→HxR(99%)；蟹类中，汤水粉等[19]从梭子蟹(Portunustrituberculatus)体内检测到大量的IMP；对于贝类，SAITO[5]推测库页岛厚蛤蜊(Spisulasachalinensis)和虾夷扇贝(Pectenyessoensis)中降解途径为AMP→AdR→HxR；刘亚[20]对马氏珠母贝(Pinctadamartensi)检测时，认为其降解途径为AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

试验在缢蛏和文蛤体内检测到了IMP和AdR，都未检测到Ad，根据降解产物推测， AMP可能的分解途径为AMP→IMP→ HxR和AMP→AdR→ HxR。AMP经AMP脱氨酶作用，水解脱氨转变为IMP，再经核苷酸酶催化成HxR；或AMP经核苷酸酶作用，加水脱磷酸生成AdR，AdR在腺苷脱氨酶作用下生成HxR(图4)。HxR继而脱去1-磷酸核糖，生成Hx[21]。

图4　AMP经IMP或AdR生成HxR的结构式变化Fig.4　Chemical structure changes of HxR generated by AMP though IMP or AdR

缢蛏AMP含量下降的同时，IMP和AdR缓慢上升一段后快速下降，在第5～6天， 产物仅为AMP，IMP、AdR、HxR，AMP下降的含量为0.274 μmol/g与IMP、AdR和HxR上升的总量0.272 μmol/g几乎相同。可推测AMP降解成了IMP、AdR和HxR。因此缢蛏的AMP降解途径为： AMP→IMP→HxR和AMP→AdR→HxR。

文蛤AMP含量在第2天由峰值快速下降，同时AdR出现，并快速上升，第4天AMP的下降速率减慢，AdR的上升速率也变慢(图3)，说明AMP与 AdR的变化可能存在相关性，AdR是由AMP分解成的产物。HxR的含量较少，Hx的含量较多，推测AdR经HxR快速变为Hx，这种现象可能与文蛤中的腺苷脱氨酶及核苷磷酸化酶的活性较强有关[22]。由于在文蛤中检测到极少量的IMP，AdR最大值远大于IMP，所以文蛤核苷酸的降解途径虽为2条，但以AMP→AdR→HxR为主。

2.3鲜度评价

鱼类中核苷酸分解途径是ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，随着鲜度下降，反应向右进行，但是ATP及分解产物的总量基本恒定。K值[23]是后期产物与ATP分解产物总量的百分比，随着腐败程度加深，后期产物含量增多，K值变大，鲜度变小，由此来反映鱼类的鲜度。

(2)

计算缢蛏和文蛤8种ATP关联产物的总量，发现ATP，ADP、AMP、IMP、AdR、HxR、Hx和Xt的总量基本恒定，后期略有下降，其中2种贝类的Xt含量较高，最高可占ATP关联物总量的29%，因K值中不包括AdR和Xt，所以对K值进行补充，计算经过AdR和Xt修正的Kax值。

(3)

当2种贝类的感官评分在5～4分(新鲜可食)，Kax值基本为0%，感官评分为3时(不可食用)，此时Kax值都约为35%，后期当感官评分为2～0分(腐败)时，Kax值在50%～100%范围内,Kax值越大，鲜度越小。TVB-N值与蛋白质分解以及细菌繁殖有关，低温贮藏会抑制细菌的大量繁殖，但后期由于内外环境作用，TVB-N含量迅速增加。缢蛏和文蛤的TVB-N一品级最大值为10.8。2种贝类在此范围内的Kax值均为0%～20 %，同时将2种贝类Kax值的变化趋势与相应的感官评分和TVB-N进行相关性计算(图5，图6)，发现缢蛏Kax值与感官评分、TVB-N值的相关系数分别为-0.987，0.989(P<0.01)，文蛤分别为-0.968，0.926(P<0.01)，说明Kax值与感官评分、TVB-N均存在极显著相关性，Kax值能够反映缢蛏和文蛤的鲜度情况。

图5　在4 ℃贮藏期间缢蛏和文蛤的Kax和感官评分的变化Fig.5 Changes in Kax and Sensory of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

图6　在4 ℃贮藏期间缢蛏和文蛤的Kax和TVB-N的变化Fig.6　Changes inKax and TVB-N of Sinonovacula constricta and Meretrix meretrix. during storage at 4 ℃

3　结论

试验通过测定ATP及关联物的种类及含量变化，推测缢蛏、文蛤核苷酸的代谢途径有2条：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt。文蛤主要以后者AMP→AdR→HxR进行代谢。

Kax值的变化与感官评分和TVB-N值均存在极显著相关性，Kax指标可用于缢蛏和文蛤的鲜度评价。

[1]中国农业百科全书编辑部.中国农业百科全书(水产卷)[M].北京:农业出版社,1994: 583-584.

[2]程量,王康乐.文蛤形态学及其亚显微结构的研究[J].动物学研究,1997,18(4):5-11.

[3]农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴[M].北京:中国农业出版社,2015:23-30.

[4]刘媛,王健,孙剑峰,等.我国海洋贝类资源的利用现状和发展趋势[J].现代食品科技,2013,29(3):673-677.

[5]SAITO T, ARAIi K, MATSUYOSHI M.A new method for estimating the freshness of fish[J]. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries,1959,24(9):749-750.

[6]邱伟强,谢晶,陈舜胜,等.虾类冷藏期间ATP关联产物含量的变化及其降解途径的研究[J].现代食品科技,2015,31(10):103-181.

[7]STONE H, SIDEL J L.Sensory evaluation practices[M](3rd ed). Elsevier Academic Press, 2004:201-244.

[8]张超,励建荣,李学鹏.臭氧杀菌结合气调包装对缢蛏的保鲜效果[J].水产学报,2011,35(6):954-960.

[9]张辉,李丽娜,刘红英.复合生物保鲜剂对缢蛏保鲜效果的研究[J].2012,33(14):286-289.

[10]GB/T 27404—2008.实验室质量控制规范.食品理化检验[S].

[11]刘寿春,钟塞意,李平兰,等.三磷酸腺苷降解产物评价冷鲜罗非鱼片新鲜度[J].食品科学,2013,34(4):230-235.

[12]WATABE S, USHIO H, IWAMOTO M,et al.Temperature dependency of rigor mortis of fish muscle: myofibrillar Mg2+-ATPase activity and Ca2+uptake by sarcoplasmic reticulum[J]. Journal of Food Science,1989,54(5):1 107-1 115.

[13]汤水粉,罗方方,钱卓真,等.鱼类贮藏期间鲜度指标K值变化及鲜度评价[J].食品安全质量检测学报,2014,5(12): 4 107-4 114.

[14]WANG Qi, XUE Changhu, LI Zhaojie,et al.Changes in the contents of ATP and its related breakdown compounds in various tissues of oyster during frozen storage[J].Journal of Ocean University of China,2007,6(4):407-412.

[15]路红波,刘俊荣.水产调味料概述[J].水产学报,2005,24(3):44-46.

[16]沈月新,章超桦,薛长湖,等.水产食品学[M].北京:中国农业出版社,2011:159-194.

[17]杨文鸽,徐大伦,孙翠玲,等.缢蛏冰藏保活期间呈味物质的变化[J].中国食品学报,2009,9(3):181-186.

[18]董彩文.鱼肉鲜度测定方法研究进展[J].食品与发酵工业,2004,30(4):99-103.

[19]汤水粉,钱卓真,罗方方,等.高效液相色谱法测定水产品中ATP关联化合物[J].渔业科学进展,2014,35(2):110-116.

[20]刘亚,章超桦,陆子锋.高效液相色谱法检测水产品中的ATP关联化合物[J].食品与发酵工业,2010,36(6):137-141.

[21]张楚富,程汉华,刘德立.生物化学原理[M].北京:高等教育出版社,2011:504-505.

[22]SONIA P, ANTONIO V, IZASKUN I.Simultaneous determination of adenosine and related purines in tissues and hemolymph of mussel by HPLC [J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,2013,36(4):470-485.

[23]ALASAL V C, TAYLOR K, SHAHIDI F.Comparative quality assessment of cultured and wild seabream (Sparus aurata) stored in ice and at chill temperature (4 ℃)[J].Food Chemistry,2008,108(3):933-941.

Changes of ATP- related compounds and degradation pathways inSinonovaculaconstrictaandMeretrixmeretrixduring chilled storage

WANG Dan-ni, QIU Wei-qiang, CHEN Shun-sheng*, SONG Xue

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China)

The changes of ATP-related compounds and freshness evaluation were investigated inSinonovaculaconstricta,Meretrixmeretrixduring 4 ℃storage. The investigation was performed using HPLC- DAD. Nine kinds of compounds were identified: adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate (AMP), inosinic acid (IMP), adenosine (AdR), inosine (HxR), hypoxanthine (Hx), xanthine (Xt), adenine (Ad). It was found that initial values of ATP in two shellfish samples stored at 4 ℃ were 1.033 μmol/g，0.824 μmoL/g, respectively. However, they were rapidly declined at the beginning of the four day, and then the decrease was slowed down. ADP were declining, AMP, IMP, AdR, HxR all showed first increased and then decreased. Xt were rising. Hx inS.constrictawere rising but inM.meretrixwas first increased and then decreased. Ad were not detected in two shellfishes.M.meretrixhad little IMP. According to changes in ATP-related compounds, it was speculated the degradation pathways of two shellfishes might be: ATP → ADP → AMP → IMP → HxR → Hx→ Xt , ATP → ADP → AMP → AdR → HxR → Hx → Xt. Combined with sensory evaluation and TVB-N，Kax-value was highly significantly correlated with sensory scores and TVB-N values. Kax-value could be used to review the fresh degree of two species of shellfishes.

Sinonovaculaconstricta;Meretrixmeretrix; ATP-related compounds; degradation pathway; high performance liquid chromatography(HPLC)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609039

硕士研究生(陈舜胜教授为通讯作者,E-mail：sschen@shou.edu.cn)。

国家自然科学基金资助项目(No.31471685)；上海市科委工程中心建设：上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心(11DZ2280300)；上海海洋大学科技发展专项(A2-0209-15-200008)

2015-12-22，改回日期：2016-03-03