基于ITS2条形码鉴定维药药西瓜及其误用品△

何江，程波，徐元，姚松伯，杨伟俊

(1.新疆维吾尔自治区药物研究所 新疆维吾尔药重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830004.)

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基于ITS2条形码鉴定维药药西瓜及其误用品△

何江，程波，徐元，姚松伯，杨伟俊*

(1.新疆维吾尔自治区药物研究所 新疆维吾尔药重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830004.)

目的：采用ITS2条形码对维吾尔药材药西瓜及其误用品栝楼、罗汉果进行分子鉴定，以确保药材质量及临床疗效。方法：提取维吾尔药材药西瓜及其误用品栝楼、罗汉果的DNA，并对药材进行PCR扩增其ITS2 (internal transcribed spacer 2)并双向测序，经CodonCode Alingner V3.0 对其测序峰图进行校对拼接后，用MEGA6.05软件计算种内种间遗传距离K2P (kimura 2-parameter)，并构建邻接系统聚类树NJ(neighbor-joingtree，NJTree)。结果：提取维吾尔药材药西瓜及误用品栝楼、罗汉果基因组DNA后，经检测具降解现象，但仍可通过PCR扩增获得三者的ITS2序列；药西瓜与误用品之间的K2P遗传距离远大于药西瓜种内遗传距离；NJ系统聚类树结果表明能将药西瓜与其误用品区分开来，单独聚为一类。结论：ITS2条形码可准确鉴别维吾尔药材药西瓜及其误用品，为药西瓜的质量和临床用药安全提供了鉴定依据。

药西瓜；ITS2条形码；鉴定；误用品

前言

维吾尔族常用药材药西瓜又称之为苦西瓜、苦苹果。为葫芦科植物苦药西瓜Citrulluscolocynthis(L.)Schrad.成熟干燥的果实，具有清热泻火、健胃消食、治疗各种头痛、关节炎、月经不通、驱痰证、黑胆液、神经性痰病等疗效[1-2]。药西瓜主要分布于亚洲的西部、中部、地中海地区、欧洲的西部以及及南部、非洲北部。其原产于亚洲热带及非洲地区。由于药西瓜主要由国外进口，最近几十年来，随着维吾尔医药学的迅速发展，药西瓜的进口量早已不能满足临床用药的需求。目前，在新疆维吾尔自治区的和田、玛纳斯等地虽有栽培，但均处于试验性质，产量甚微，因而出现了供不应求的局面，故在维吾尔药材市场出现了以其同科植物如栝楼、罗汉果等药材替代药西瓜误用于临床的现象，影响了临床用药安全与准确[2]。其误用品栝楼为葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.及双边栝楼TrichosanthesrosthoriniiHarms.成熟干燥的果实[3-4]，罗汉果为葫芦科植物罗汉果Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.jeffery.成熟干燥的果实[5]。虽然三者同为葫芦科植物，但栝楼和罗汉果均属于中医用药，据考证在维吾尔医学史籍中无临床应用的记载。药西瓜的药性、功能主治、有效化学成分、药理作用等均与栝楼、罗汉果不同，不可以相互替使代用[6-9]。本研究利用了植物DNA条形码中ITS2序列对维吾尔药材药西瓜及其误用品栝楼、罗汉果进行鉴定研究，为该药材准确快速鉴定提供科学依据，以确保药材质量以及临床安全用药。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料 实验材料均于2011年至2015年收集，来源见表1.包括实验样品及来自于Genbank下载的序列。所有样品由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定，样品保存于新疆维吾尔自治区药物研究所。

表1 样品来源

1.1.2 试剂 三氯甲烷(天津市风船化学试剂科技有限公司)、Taq酶、dNTPs、Buffer、引物、植物基因组DNA提取试剂盒均购自北京天根生物科技有限公司，琼脂糖(Biowest 111860Regular AGAROSE G-10 西班牙)。

1.1.3 仪器 高速低温离心机Eppendorf 5424型(德国Eppendorf公司)；PCR仪BIO-RAD C-1000TM (美国)；凝胶成像仪BIO-RAD Del DocTMXR+(美国)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 依据北京天根生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取：

1.2.2 PCR扩增、琼脂糖核酸电泳检测及测序 参照WU Jin-song等人ITS2基因扩增方法[10-11]，ITS2 PCR扩增正向引物为ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物为ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反应体系体积为30 μL，体系内含Taq酶0.3 ul、PCR buffer 3.0 μL、dNTP 3.0 μL、正反向引物各1 μL、H2O 16.7 ul、总DNA 5 ul。PCR反应体系条件为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s；40 cycles；72 ℃，10 min。之后在1%琼脂糖核酸电泳检测，检测合格后PCR产物直接交由北京华大基因公司进行双向测序。

1.2.3 序列处理 将测序峰图应用Codon Code Aligner V3.0软件进行校对与拼接，去除低质量序列以及引物区，获得ITS2序列，使用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法[12]，去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列，待用。

1.2.4 数据分析 将所有序列用软件MEGA6.05分析比对，并基于Kimura2-parameter(K2P)模型进行种内种间遗传距离分析。所得序列采用构建邻接(NJ)系统聚类树对药西瓜及其误用品进行鉴定分析。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及PCR扩增

提取药西瓜、栝楼及罗汉果样品基因组DNA，结果如图1所示，4份药西瓜样品、4份栝楼样品和2份罗汉果样品的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳后4份药西瓜样品和4份栝楼样品的DNA出现有弥散现象的条带，而2份罗汉果样品的DNA则未出现条带。将提取药西瓜、栝楼及罗汉果样品基因组DNA进行PCR扩增。结果如图2所示，4份药西瓜样品、4份栝楼样品和2份罗汉果样品的ITS2序列经1%的琼脂糖凝胶电泳后均出现清晰、单一条带。说明药材DNA虽有降解，但仍可通过PCR扩增获得其ITS2序列。

注：M：Marker；1～4：药西瓜；5～8：栝楼；9、10：罗汉果图1 DNA提取电泳结果

注：M：Marker；1～4：药西瓜；5～8：栝楼；9、10：罗汉果图2 ITS2 PCR扩增结果

2.2 药西瓜与其误用品植物ITS2序列种内和种间比较

根据K2P参数遗传距离模型计算得到的序列间遗传距离，见表2.药西瓜种内K2P距离为0～0.044，栝楼种内K2P距离为0～0.005，罗汉果种内K2P距离为0.014.药西瓜与栝楼的种间的K2P距离为0～0.156，药西瓜与罗汉果种间K2P距离为0.044～0.166.经各样本种内种间遗传距离分析结果表明基原物种与误用品之间的遗传距离远大于药西瓜种内遗传距离。因此，ITS2序列能够将药西瓜与其误用品区分开。

2.3 药西瓜及其误用品NJ树

基于ITS2序列，通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图(图3)可以看出药西瓜4个样品单独聚为一支，栝楼4个样品单独聚为一支，罗汉果2个样品单独聚为一支。可明显将药西瓜与其误用品区分，

表2 ITS2序列的K2P遗传距离

表明ITS2条形码可以准确的鉴别药西瓜与其误用品栝楼、罗汉果。

图3 基于TIS2序列构建的药西瓜及其误用品的邻接(NJ)树

3 讨论

ITS2是真核生物rDNA上的一段顺反子，在种间具有显著的特异性，被广泛用于物种分类、系统进化和植物条形码研究。同时中药材不同于新鲜的样品，其DNA在生产过程经过加工、炮制等过程，必定会发生不同程度的降解，ITS2序列短，更有利于获取发生降解的样本序列，这对于中药材DNA条形码在实际中的应用具有重要的意义[13]。本研究结果也表明，药西瓜、栝楼以及罗汉果药材样本采用试剂盒一般都能成功提取其DNA，而且发现其基因组DNA电泳呈弥散状态，少数不可见，这说明药材样品DNA已经发生了一定程度的降解。但其ITS2扩增产物电泳后都可以出现单一明亮条带并测序成功，这表明ITS2条形码易于扩增，确实适合于本研究药材的鉴定。

李妮[14]等曾葫芦科的新鲜的实验样本进行ITS2条形码研究，在属水平上的鉴定成功率是100%，种水平可达88.5%。这是由于ITS2序列可基于隐马尔可夫模型去除两端5.8S和26S区段，获得完整ITS2间隔区序列，使后续数据处理更准确可靠，这也是目前其他候选条形码序列不具备的优势[13]。而本实验利用干燥的药材样品(最早为2011年样品)也获得了完整ITS2序列，并通过数据分析，发现药西瓜及其误用品间种内最大K2P距离均小于种间最小K2P

距离，邻接NJ树中药西瓜与其误用品各自分别聚为一支，可明显的把药西瓜与其误用品栝楼、罗汉果区分开。因此，应用ITS2条形码能够准确快速鉴定维吾尔药材药西瓜与其误用品，为药西瓜的质量和临床用药安全提供了鉴定依据。

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MolecularIdentificationofUyghurMedicineCitrullusColocynthisFructusandIt’sMisuseSpeciesBasedonITS2barcode

HE Jiang，CHENG Bo，XU Yuan，YAO Songbo，YANG Weijun*

(UygurMedicinekeylabofXinjiangInstituteofMateria，Urumqi830004，China)

Objective：To identify Uyghur medicine Citrullus Colocynthis Fructus (Citrulluscolocynthis(L.) Schrad.) and it’s misuse species Trichosanthis Fructus (TrichosantheskirilowiiMaxim.)，Siraitiae Fructus (Siraitiagrosvenorii(Swingle) C.Jeffery.) by using ITS2 (internal transcribed spacer 2) barcode，which would guarantee the quality and clinical effect of this medical material.Methods：DNA extracted from Citrullus Colocynthis Fructus and it’s both misuse species were used as template，the ITS2 region was amplified by PCR and sequenced bidirectionally.ITS2 sequences were collated and matched by using Codon Code Aligner V3.0，K2P (kimura 2-parameter) model using MEGA 5.0 software and neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree was established.Result：DNA of Uyghur medicines Citrullus Colocynthis Fructus and it’s both misuse species were extracted，which had degraded，but which ITS2 sequences could still been obtained by PCR.the intra-specific genetic distances were also smaller than inter-specific one.Results of NJ phylogenetic tree showed that Citrullus Colocynthis Fructus could be distinguished from its misuse species and classified into a separate one.Conclusion：ITS2 barcode can accurate identification of Citrullus Colocynthis Fructus and its misuse species，and provide reference for quality and safety using of Citrullus Colocynthis Fructus.

Citrullus Colocynthis Fructus；ITS2 barcode；identify；misuse species

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.005

2016-01-18)

“欧矢车菊根”等进口及地产维药材标准的建立与提高(201130105-2)

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杨伟俊，研究员，研究方向：药用植物资源；Tel：0991-2320292，E-mail：wilfred3106@163.com