肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的制备及体外透皮实验△

许欢欢，胡君萍，吴姗姗，朱丹丹，居博伟 ，曹丹丹，杨建华

(1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

·中药工业·

肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的制备及体外透皮实验△

许欢欢1，胡君萍1，吴姗姗1，朱丹丹1，居博伟1，曹丹丹1，杨建华2*

(1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的：制备以肉苁蓉苯乙醇总苷为功能成分的美白防晒透皮吸收新剂型传递体，并对其进行质量评价及体外透皮性能的研究。方法：采用均匀设计筛选逆相蒸发法制备肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的最佳处方，并对传递体的粒径、形态、电位和稳定性进行评价。采用改良的Franz扩散池考察其透皮效率以及24 h累积释放量情况。结果：均匀设计筛选逆相蒸发法的最佳处方为卵磷脂与药物的质量比140∶10，卵磷脂与胆固醇的质量比140∶15，卵磷脂与胆酸钠的质量比为140∶33，油相与水相的体积比2.49。制得的传递体为淡黄色半透明混悬液，平均包封率为37.5%。在电镜下观察其外形呈较规则的球形或类球形，光滑且不黏连，平均粒径190.7 nm，Zeta电位为-35.93 mV。于4 ℃下放置60 d，未产生聚积或沉淀。肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的稳态渗透速率与24 h的累积透皮量均大于肉苁蓉苯乙醇苷饱和水溶液。结论：肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的制备工艺可行，以传递体为载体可以增加肉苁蓉苯乙醇苷透皮转运和皮肤的滞留量，为肉苁蓉苯乙醇总苷在美白防晒化妆品中的应用提供了透皮吸收新剂型。

肉苁蓉；苯乙醇总苷；传递体；均匀设计；体外透皮

黑色素是影响肤色的最主要因素，其合成过多会引起雀斑、黄褐斑等。其次，过多接触紫外线可导致皮肤皱纹增多、皮肤光老化、皮肤癌变等一系列皮肤疾病。随着“回归大自然”的理念日渐深入人心，天然美白防晒产品的开发已成为化妆品领域一个研究热点。课题组前期研究显示[1-2]，肉苁蓉苯乙醇总苷对人体黑素合成的主要限速酶—酪氨酸酶的活性具有明显的抑制作用，以肉苁蓉苯乙醇总苷为主要功能成分的乳剂对中波紫外线(UVB)照射致小鼠皮肤色素沉着光老化模型具有显著保护作用。通过进一步的研究，课题组又从肉苁蓉中提取分离得到了纯度高、制备量较大的系列苯乙醇苷衍生物，并以对人皮黑素细胞增殖活性及黑素合成含量的影响为指标对系列苯乙醇苷衍生物的抑制皮肤色素沉着作用做了初步考察。结果表明，它们均能显著抑制人皮黑色素细胞的增殖活性，同时还可明显降低人皮黑色素细胞黑素的含量。以上研究表明，苯乙醇苷是肉苁蓉具有美白、防晒功能的主要物质基础。

目前对肉苁蓉苯乙醇总苷透皮给药的研究未见报道，鉴于其本身具有的特殊功能，合理设计肉苁蓉苯乙醇苷透皮给药制剂有现实意义。传递体是在脂质体基础上，在磷脂成分中加入胆酸钠等表面活性剂制备成的自聚泡囊。其有高亲水性、高渗透性和高效变形性等特点，能使目标药物更易穿过角质层或表皮类脂，增强药物在皮肤局部积累，从而起到皮肤靶向与药物持续释放的效果，传递体是透皮效果优于脂质体的新型经皮渗透载体[3]。为改善苯乙醇苷的透皮吸收效果，充分发挥药效，本研究制备了肉苁蓉苯乙醇总苷的新剂型传递体，并对其质量进行评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-200VDB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Sartorius BP211D电子天平(METTLER)；UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津)；pH计(METTLER TOLEDO)；RH basic2磁力搅拌器、MS3 basic涡旋仪(IKA)；Nano-ZS90马尔文粒度激光仪(Malvern)；TT-6B透皮吸收扩散仪(天津正通科技有限公司)。

1.2 试药

松果菊苷对照品(自制，UV、IR、EI-MS、1H NMR和13C NMR 数据符合文献值[4]，经HPLC面积归一化法测定纯度大于98%)；肉苁蓉总苷(自制，UV法测得肉苁蓉苯乙醇总苷含量高达87%，HPLC测得松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分别为37.8%、17.7%)；大豆卵磷脂、胆固醇(上海蓝季科技发展有限公司)；胆酸钠(北京奥博星生物技术有限公司)；葡聚糖凝胶(G-50，瑞典Pharmacia公司进口分装)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 肉苁蓉苯乙醇总苷传递体含量测定方法的建立

2.1.1 逆相蒸发法制备肉苁蓉苯乙醇总苷传递体精密称取适量大豆卵磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加适量三氯甲烷充分溶解，于37 ℃减压旋转蒸发，挥去三氯甲烷。待三氯甲烷挥尽后继续抽真空约40 min，取下茄形瓶加入适量胆酸钠和肉苁蓉苯乙醇总苷混合溶液，于37 ℃水化2 h，水化全后即得肉苁蓉苯乙醇总苷传递体，依次通过0.45、0.22 μm的微孔滤膜，即得。

2.1.2 测定波长的选择 分别扫描松果菊苷对照品异丙醇溶液和肉苁蓉苯乙醇总苷传质体、肉苁蓉苯乙醇总苷、空白传递体(除不加肉苁蓉苯乙醇总苷外，其余同2.1.1项下操作)3种供试品异丙醇溶液的紫外光谱图，结果前三者的紫外图谱基本一致，空白不干扰，最大吸收波长均为333 nm。故选择松果菊苷为对照品，采用紫外光谱法测定苯乙醇总苷的含量。

2.1.3 标准曲线的制备 精密称取松果菊苷对照品1 mg，溶于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0.1 mg·mL-1的松果菊苷对照品溶液。分别精密吸取适量对照品溶液于5 mL量瓶中，用异丙醇定容至刻度，配成质量浓度分别为4.72、11.80、18.88、25.96、33.04 μg·mL-1的溶液，于333 nm处测定吸光度值。以吸光度值对浓度进行线性回归，得标准曲线方程：Y= 0.026 0X+0.015 3，r= 0.999 5。表明在4.72～33.04 μg·mL-1吸光度与浓度呈良好线性关系。

2.1.4 精密度试验 配制高、中、低3个浓度的松果菊苷对照品溶液，1 d内于不同时间测定333 nm处吸光度，结果日内RSD分别为0.78%、0.92%、0.89%(n=6)；连续5 d测定吸光度值，结果日间RSD 分别为 0.72%、0.26%、0.23%(n=5)。表明其日内及日间精密度良好。

2.1.5 重复性试验 精密移取肉苁蓉苯乙醇总苷传递体1 mL，用异丙醇超声溶解，并用异丙醇定容到10 mL，即为肉苁蓉苯乙醇总苷传递体供试品溶液。按照上述操作平行制备6份，测定吸光度，结果RSD = 0.67%，表明方法重复性良好。

2.1.6 回收率试验 取肉苁蓉苯乙醇总苷传递体0.5 mL，分别加入高、中、低浓度的松果菊苷对照品溶液，加异丙醇超声破乳并定容，分别平行试验3份，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n = 9)

2.1.7 包封率的测定 预试验中发现，采用凝胶柱色谱法可以将包裹好的传递体与未包裹的药物完全分离，回收率可达到99.59%，故选择凝胶柱色谱法测定传递体包封率[5]。取制备好的传递体1 mL，上样于凝胶柱，用pH 6.8的磷酸缓冲液洗脱，接收15～40 mL的洗脱液，定容至50 mL容量瓶，紫外法测游离药量。另取1 mL传递体样品于50 mL量瓶内，加入少许异丙醇超声破乳，再加磷酸盐定容至刻度，测总药量。计算包封率EE(%)。

2.2 肉苁蓉苯乙醇总苷传递体制备方法的考察

分别采用薄膜分散法、逆相蒸发法和乙醇注入法制备肉苁蓉苯乙醇总苷传递体，测定不同制备方法所得传递体中药物的包封率。

2.2.1 薄膜分散法 定量称取豆磷脂、硬脂酸置茄形瓶中，加入乙醚，振摇，使完全溶解，得类脂溶液。将茄形瓶置旋转蒸发器上，于45 ℃减压蒸发溶剂，使形成均匀薄膜，另将肉苁蓉苯乙醇总苷、胆酸钠溶于磷酸盐缓冲液，加入上述茄形瓶，常压旋转洗膜，以0.45、0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得肉苁蓉苯乙醇总苷传递体。

2.2.2 逆相蒸发法 定量称取卵磷脂、胆固醇于圆底烧瓶中，加乙醚溶解，另取肉苁蓉苯乙醇总苷、胆酸钠溶于磷酸盐缓冲液，再与上述乙醚溶液混合，磁力搅拌器使形成W/0型乳剂，45 ℃减压旋转蒸发，除三氯甲烷，得半固体胶状物，再以适量磷酸盐缓冲液水合，以0.45、0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得肉苁蓉苯乙醇总苷传递体，测定包封率。

2.2.3 乙醇注入法 定量称取肉苁蓉苯乙醇总苷、卵磷脂、胆酸钠、胆固醇，加乙醇使完全溶解，在不断搅拌下，缓慢注入60 ℃磷酸盐缓冲液中，加完后继续搅拌1 h至乙醇挥尽。以0.45、0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得肉苁蓉苯乙醇总苷传递体，测得包封率。

按2.1.7项下操作，测定以上3种制备方法制备的传递体中药物的包封率，结果见图1。逆向蒸发法制备的传递体中药物的包封率最高。

图1 制备方法对肉苁蓉苯乙醇总苷传递体包封率的影响

2.3 均匀设计试验优化处方

采用逆相蒸发法制备传递体，根据预试验结果，筛选出制备肉苁蓉苯乙醇总苷传递体时影响其包封率的4个主要因素：药与卵磷脂质量比(X1)、胆固醇与卵磷脂质量比(X2)、胆酸钠与卵磷脂的质量比(X3)、油相与水相的体积比(X4)，故采用 U9(94)均匀试验优选工艺条件，见表2。

采用均匀设计软件进行多元回归处理，得回归方程：Y= -19.067 4 + 12.519 7X3+ 5.953 4X4+ 0.315 3X1X2- 0.098 2X1X3-0.673 4X2X3-0.599 1X3X3- 1.193 3X4X4。回归方程显著性检验：F=1.837 1×104，r= 0.999 9 (p< 0.01)，优化值：X1= 14∶1；X2= 9∶1；X3= 4.243∶1；X4= 2.494∶1。预测最大值为38.875%。

表2 均匀设计结果(n = 9)

2.4 验证试验

按优选处方制备3批肉苁蓉苯乙醇总苷传递体，测定包封率，见表3。结果验证值与预测值接近。

表3 样品包封率测定结果(n = 9)

2.5 质量评价

肉苁蓉苯乙醇总苷传递体外观淡黄色，略带乳光的混悬液，在透射电镜下，形态呈完整圆球形或椭圆形的球粒，表面光滑、形状规则、分散性好，相互之间没有聚集现象。见图2。采用激光散射粒径测定仪测定传递体的粒径、分布及Zeta电位，结果平均粒径为182 nm，分布均匀，见图3。Zeta电位为-35.93 mV。于4 ℃下放置60 d未产生聚积或沉淀，表明该传递体具有较好的聚结稳定性。

图2 肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的电镜图

图3 肉苁蓉苯乙醇总苷传递体的粒径分布图

2.6 肉苁蓉苯乙醇总苷体外透皮实验

2.6.1 鼠皮的制备 取健康雄性小白鼠(20 g左右)，用剪刀仔细剪去腹部皮肤上的毛，断颈处死，剥离腹部皮肤。将剥离下来的皮肤平铺于玻璃板上，角质层向下，用单背刀片小心剔除皮下脂肪和粘连物，然后用0.9%氯化钠溶液反复冲洗干净，剪成适当的大小，并检查皮肤的完整性。每次实验前，检查鼠皮的完整性，不得有任何破损。

2.6.2 累积透过量和透皮吸收速率的测定 将皮肤固定在扩散池的上、下两室之间，角质层朝上，接受液为0.9%氯化钠溶液，供给池加入肉苁蓉苯乙醇总苷传递体或肉苁蓉苯乙醇总苷水溶液1 mL，用保鲜膜覆盖池口。将透皮吸收扩散装置置于37 ℃恒温水浴中，开动搅拌(200 r·min-1)，计时，分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h 取样3 mL，同时补加相同温度等体积新鲜接受液，检测样品溶液中药物的含量，根据下式求累积渗透量Qn。以Qn对t作图，进行线性回归，求直线斜率，即为稳态渗透速率Jss[6]。见图4。

[Qn：第n小时松果菊苷的累积渗透量，V0：接收池体积(mL)，V：取样体积，Cn：第n小时接收池中的浓度]

图4 不同制剂累积释药量对时间(Q—T) 的渗透动力学曲线

不同肉苁蓉苯乙醇总苷的透皮制剂方程r24hQn(μg·cm-2)Jss(μg·cm-2·h-1)载药传递体Qn=13824t+26790093972235627±203413824±129饱和水溶液Qn=11384t+42013098272061574±257111384±157

结果表明，肉苁蓉苯乙醇苷传递体的渗透速率为13.824 μg·cm-2·h-1，累计释放量为223.563 μg·cm-2，与饱和水溶液相比，肉苁蓉苯乙醇苷传递体具有更快的渗透速率。

3 讨论

制备水溶性药物传递体，采用逆相蒸发法通常有着更高的包封率，而该方法工艺过程中能否形成稳定的W/O乳剂至关重要。研究发现，采用三氯甲烷与乙醚混合溶剂为有机溶剂，更容易形成W/O乳剂且不易分层。文献表明[8]，油水比通常在3∶1～6∶1范围内利于成乳，本试验中油水比1∶1即可成乳，可能与胆酸钠加入有关，胆酸钠本身也是一种乳化剂，利于乳剂的形成。

药物自身的理化性质对包封率影响很大。对于被动载药法(薄膜分散法、逆相蒸发法、乙醇注入法)脂溶性或水溶性(logP<-0.3或logP>4.5)特别高的药物可被包封成具有较高包封率的脂质体。苯乙醇总苷的油水分布系数约为1，故制得的传递体中药物的包封率较低。

破乳剂破乳效果的好坏直接影响包封率测定的准确性。本实验比较了甲醇、无水乙醇、异丙醇等常用的破乳剂，结果表明，异丙醇的破乳效果最佳，与甲醇、无水乙醇相比用量小，破乳后，药物的回收率高。这可能是由于有机溶剂破乳的机制是基于极性相似相容原理，传递体膜材的主要成分为卵磷脂，其极性较小，在异丙醇中更易被溶解。

传递体是将膜软化剂(主要是以胆酸盐为主的表面活性剂)加入到类脂材料中，制成的新型多功能透皮药物载体，具有高效渗透性、高度柔韧性、高度自身形变性，可高效穿过比其小数倍的皮肤孔道。表面活性剂的添加与否是传递体与常规脂质体最主要的区别[7]。由于磷脂分子中有不饱和脂肪酸链，过高的温度下游离离子等会使磷脂疏水链断裂，分子膜流动性降低，药物泄漏加剧，故本实验考察了胆酸钠对传递体稳定性与包封率的影响。结果表明，使用胆酸钠作为表面活性剂，当胆酸钠与磷脂比为1∶4时，制备的传递体包封率最高，稳定性也较好。

均匀设计试验表明，类脂材料的增加可以提高药物的包封率：一方面，类脂越多，药物被包裹的几率越大；另一方面，卵磷脂带负电荷，卵磷脂越多，所带的负电荷越多，由于同电荷的相互排斥，使双分子间的距离增大，易包裹更多亲水的药物。但类脂的加入量也不宜过多，否则会导致传递体的粒径偏大，引起聚集，使制剂的稳定性显著下降。

体外透皮实验显示，肉苁蓉苯乙醇总苷传递体与苯乙醇总苷饱和水溶液相比具有较高的透皮渗透速率，这主要是基于传递体的高度变形性和亲水性。良好的透皮渗透效果使药物能够发挥更高的药效。

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PreparationofPhenylethanoidGlycosidesTransfersomesandTransdermalExperimentsinvitro

XU Huanhuan1，HU Junping1，WU Shanshan1，ZHU Dandan1，JU Bowei1，CAO Dandan1，YANG Jianhua2*

(1.CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；2.TheFirstAffiliatedHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：The present study was designed to develop a transfersomes formulation of phenylethanoid glycosides (PG) for skin lightener and sunscreen，further evaluate the qualities and study on transdermal resorptioninvivo.Methods：Uniform design was applied to optimize the formulation of reverse phase evaporation.The particle size，appearance，Z-potential，and the stability of formulation were also evaluated，respectively.Using modified Franz diffusion cell and UV spectrophotometric method for the determination of receiving solution PG content，the penetration efficiency of skin and 24 h cumulative release were evaluated amount.Results：The optimum prescription of the uniform design were as follows：the ratio of soya lecithin/PG was 200∶30，lecithin/cholesterol was 140∶15，oil phase/water phase was 2.49，respectively.The obtained transfersomes were light yellow translucent suspension，with a mean encapsulation efficiency of 37.5%.The shape of the particles was spherical or spherical-likely under microscope，which was smooth and non-conglutinated with an average diameter of 190.7 nm，and a Z-potential of -35.93 mV.Aggregation or deposition was not observed after exposure under the temperature of 4℃ for 60 d.The cumulative amount of PG and the permeability coefficient in the transfersomes were higher than that of PG in the control solution.Conclusion：The preparation technology of PG is feasible，transfersomes as the carrier can increase the PG through transporter skin retention and provides a new dosage form of transdermal absorption for PG in whitening sunscreen cosmetics application.

Cistanche；phenylethanoid glycosides；transfersomes；uniform design；Franz diffusion

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.018

2016-01-15)

国家自然科学基金项目(81360670，81560629)；新疆维吾尔自治区优秀青年科技创新人才培养工程项目(2014721050)

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杨建华，教授，研究方向：天然药用资源的开发与利用；E-mail：yjh-yft@163.com