HPLC法同时测定猴头菇提取物中3种核苷

汪杨丽，陈晓虎，王慧，苏晶

(重庆市食品药品检验检测研究院 重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121)

·中药工业·

HPLC法同时测定猴头菇提取物中3种核苷

汪杨丽*，陈晓虎，王慧，苏晶

(重庆市食品药品检验检测研究院 重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121)

目的：建立高效液相色谱法同时测定猴头菇提取物中尿苷、鸟苷和腺苷的含量。方法：采用Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈- 0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液，梯度洗脱；检测波长为260 nm。结果：尿苷、鸟苷、腺苷的线性范围分别为0.034 43～0.688 6 μg(r=1)、0.022 26～0.445 1 μg(r=1 )、0.026 93～0.538 6 μg(r=0.999 9)，尿苷、鸟苷、腺苷的平均回收率(n=6)分别为97.6%(RSD=2.0%)、96.3%(RSD=1.0%)、96.3%(RSD=0.8%)。结论：该方法简便、准确、可行，可为猴头菇提取物的生产和使用提供质量评价依据。

猴头菇提取物；核苷；高效液相色谱法

猴头菇为齿菌科猴头菌Hericumerinaceus(Bull.)Pers.的子实体[1]，为药食两用的真菌，入药能助消化、利五脏、促进肠胃功能，并能提高人体的免疫力[2]。猴头菇含有多糖、核苷化合物、氨基酸等成分。有关猴头菇多糖[1，3-4]的提取及含量测定的研究较多，戚雁飞[5]仅对猴头菇中腺苷进行确认和含量测定。猴头菇提取物是猴头菇子实体的水浸提液以10∶1的比例干燥浓缩干燥而得。本试验参考相关文献，采用高效液相色谱法，应用梯度洗脱测定猴头菇提取物中的尿苷、鸟苷、腺苷的含量。结果表明，该方法简便、准确、重复性好，可作为猴头菇提取物的质量控制方法之一，为猴头菇保健品和药品的进一步开发利用提供质量评价依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695-2489高效液相色谱仪系统；Bp221s 型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Ax205电子天平(梅特勒公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；3-30KS离心机(德国Sigma公司)。

1.2 试药

尿苷对照品、鸟苷对照品(SIGMA公司，批号分别为1181124,101474373);腺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110879-200202)；猴头菇提取物(纽西兰安发保健品有限公司)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱；乙腈为流动相A，0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱，见表1；检测波长为260 nm；体积流量为1.0 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱色谱条件

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取尿苷、鸟苷、腺苷对照品适量，加水溶解，制成尿苷对照品储备液(质量浓度为0.430 4 mg·mL-1)、鸟苷对照品储备液(质量浓度为0.556 4 mg·mL-1)和腺苷对照品储备液(质量浓度为0.336 6 mg·mL-1)。精密量取鸟苷对照品储备液1 mL，尿苷和腺苷对照品储备液各2 mL，同置25 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得混合对照品溶液,冷藏保存。

2.3 供试品溶液的制备

取猴头菇提取物适量，研细，混匀，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率：450 W，频率：50 Khz)，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，离心10 min(7000 r·min-1)，取上清液10 mL，蒸干，残渣加水溶解，转移至25 mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验

分别精密吸取对照品、供试品溶液及水各10 μL，按上述色谱条件进行测定。结果供试品色谱中，在与尿苷、鸟苷、腺苷对照品相同的保留时间处均有吸收峰，而水液在此保留时间无干扰，见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.尿苷；2.鸟苷；3.腺苷。图1 尿苷、鸟苷、腺苷的高效液相色谱图

2.5 线性关系考察

取2.2项下的混合对照品溶液，按上述色谱条件，分别进样1、5、10、15、20 μL测定。以进样质量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得尿苷、鸟苷、腺苷回归方程分别为Y=2×106X-5 650.1(r=1)、Y=2×106X-7 488.5(r=1)、Y=3×106X-10 816(r=0.999 9)。结果表明，尿苷、鸟苷、腺苷分别在0.034 43～0.688 6、0.022 26～0.445 1、0.026 93～0.538 6 μg线性关系良好。

2.6 精密度试验

取2.2项下的尿苷、鸟苷、腺苷混合对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积，结果尿苷、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.04%、1.0%、0.06%,表明精密度良好。

2.7 稳定性考察

取同一批号样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样10 μL，测定峰面积，计算尿苷、鸟苷、腺苷的峰面积RSD分别为0.08%、1.7%、1.5 %，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

2.8 重复性考察

取同一批号样品，按2.2项方法分别制备6份供试品溶液，分别测定尿苷、鸟苷、腺苷的含量，6次重复测定结果的RSD分别为0.76%、0.98%、1.7%。

2.9 加样回收率试验

分别精密量取尿苷对照品溶液(0.326 4 mg·mL-1)2.3 mL、鸟苷对照品溶液(0.476 4 mg·mL-1)1.0 mL、腺苷对照品溶液(0.336 6 mg·mL-1)1.7 mL，置锥形瓶中(平行6份)，置水浴上蒸干，加入已知含量的样品(尿苷质量分数为2.8 mg·g-1、鸟苷质量分数为1.6 mg·g-1、腺苷质量分数为2.0 mg·g-1)约0.3 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 尿苷、鸟苷、腺苷的加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品的测定

取3批猴头菇提取物，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，用外标法计算，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=3) /mg·g-1

3 讨论

3.1 提取方法的选择

试验中选用了体积分数为20%、50%、70%甲醇作为提取溶剂，进行超声提取，结果表明，70%甲醇提取的样品充分，杂质少。比较超声20、30、40 min样品中各组分的提取率，发现30 min提取效率高。核苷类成分水溶性较好，若采用甲醇-水混合溶液溶解样品，易造成色谱峰分叉，故选用70%提取液蒸干后用水溶解。

3.2 流动相的选择

参考相关文献[6-8]，分别采用甲醇-水、甲醇-磷酸缓冲盐(pH=6.5)、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾等作为流动相体系，梯度洗脱。结果表明，本试验使用的流动相体系能使供试品色谱图基线平稳，色谱峰分离度好、峰形尖锐、对称性好、保留时间适宜，且方法的重复性好。

3.3 供试品溶液终浓度的选择

3批样品的三苷含量较高，考虑到药材质量的波动可能使供试品溶液进样量超出线性范围，因此供试品提取后最终用水溶解并定容至25 mL，其较定容至10 mL更合理。不同批次猴头菇提取物之间尿苷、鸟苷、腺苷的含量较稳定，表明三苷可以作为一个稳定的控制因子，为猴头菇提取物提供质量分析指标。

[1] 贾联盟，刘柳，董群，等.猴头菇子实体中的主要多糖成分[J].中草药，2005，36(1)：10-12.

[2] 杜鹃，王琰.猴头菇种7种金属元素含量分析[J].微量元素与健康研究，2010，27(1)：46-47.

[3] 猴梁华，李雪华，陆亚春.猴头菇多糖提取工艺研究[J].食品与机械，2006，22(1)：35-38.

[4] 张帅，沈楚燕，董基.酶法提取猴头菇多糖的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2010，31(2)：76-79.

[5] 戚雁飞.HPLC测定复方猴头胶囊中腺苷的含量[J].中成药，2002，24(3)：181-183.

[6] 孙忠华，肖建辉，迟强，等.高效液相色谱法测定三种虫草发酵液与菌丝体核苷化合物含量[J].天然产物研究与开发，2014，26(12)：2000-2003.

[7] 颜栋林.HPLC法测定冬草夏草胶囊中腺苷含量[J].药学实践杂志，2010，28(4)：293-294.

[8] 武彦舒，周丹蕾，鄢丹.天然虫草与虫草菌丝体的HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2008，33(19)：2212-2214.

SimultaneousDeterminationofThreeNucleosidesinHericumerinaceusExtractbyHPLC

WANG Yangli*，CHEN Xiaohu，WANG Hui，SU Jing

(ChongqingInstituteforFoodandDrugControl，ChongqingEngineeringTechnologyResearchCenterforPharmaceuticalProcessandQualityControl，Chongqing401121，China)

Objective：To establish an HPLC method to simultaneously determine the contents of uridine，guanosine and adenosine inHericumerinaceusextract.Methods：Welch Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5μm) was used for determination.Acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate solution was used as the mobile phase in a gradient elution mode，and the detection wavelength was 260 nm.Results：The linearity ranges obtained from calibration curves of uridine，guanosine and adenosine were 0.034 43～0.688 6 μg (r=1)，0.022 26 ～ 0.445 1 μg (r=1)，0.026 93～0.538 6 μg (r=0.999 9)，respectively.The average recoveries (n=6) were 97.6%(RSD=2.0%)，96.3%(RSD=1.0%)，96.3%(RSD=0.8%)，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and validated，which can be used for the quality evaluation ofH.erinaceusextract.

Hericumerinaceusextract；nucleoside；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.022

2015-12-04)

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汪杨丽，主管中药师，研究方向：中药分析；E-mail：wangyangli81@163.com