星点设计—效应面法优选芪天颗粒醇提工艺△

何承辉，刘宣麟，古丽斯坦·阿吾提，邢建国*，王巧梅

(1.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004；2.石河子大学，新疆 石河子 832000)

·中药工业·

星点设计—效应面法优选芪天颗粒醇提工艺△

何承辉1，刘宣麟1，古丽斯坦·阿吾提1，邢建国1*，王巧梅2

(1.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004；2.石河子大学，新疆 石河子 832000)

目的：优选芪天颗粒醇提最优工艺。方法：采用星点设计—效应面法，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间为主要影响因素，芍药苷、红景天苷2种成分含量为评价指标，通过对各因素的多元线性回归及二项式拟合，采用效应面法和等高线叠加优选最佳提取工艺，并进行预测分析。结果：确定芪天颗粒醇提的最佳提取工艺为加10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。结论：星点设计—效应面法优选芪天颗粒醇提工艺，实际值与预测值吻合度高，预测性良好，方法简单易行，对工业生产有一定的意义。

星点设计；芪天颗粒；芍药苷；红景天苷；提取工艺；效应面

芪天颗粒是在新疆一老中医多年临床常用汤剂的基础上开发研制的口服制剂，由黄芪、赤芍、红景天等4味中药组成，具有益气活血、养心通脉、化瘀止痛之功能，在临床用于气虚血瘀所致的冠心病心绞痛。处方中黄芪含有皂苷类有效成分，赤芍中含有单萜及其苷类化合物，红景天中含苷类成分，这些有效成分含有益气行血、活血化瘀、通络开窍等药理作用[1-3]。因此，根据各药材有效部位和有效成分的理化性质，对黄芪、赤芍、红景天这3味药材选用乙醇提取。在实验设计上采用了精度较高、预测性较好的星点设计，以2种苷类成分为评价指标进行综合评分，绘制三维效应曲面关系图，采用等高线俩俩叠加的方式进行优化。本实验选用星点设计—效应面法优化芪天颗粒的醇提工艺，为其工业化生产提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津)；色谱分析柱Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BS110S型电子天平(Sartoriμs)；Millipore simplicity-185超纯水器(美国密理博公司)；KQ-100DE型数控超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

芍药苷、红景天苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为110818-201005，110818-201005，供含量测定用)；色谱甲醇(美国霍尼韦尔HoneywellB&J)；磷酸(上海化学试剂有限公司，分析纯)。

黄芪、赤芍、红景天均购自于安徽省亳州市德昌药业有限公司，经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员进行鉴定，按照《中华人民共和国药典》2010年版各药材项下规定检验，均符合要求。

2 方法和结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱Kromasil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.02%磷酸(B)，梯度洗脱：0～15 min，A∶B为19∶81；15～50 min,A∶B为19∶81～27∶73；50～60 min，A∶B为27∶73；检测波长：275 nm(红景天苷，0～25 min)，230 nm(芍药苷，26～60 min)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备 按照星点试验安排的设计编码进行试验，精密称取黄芪、赤芍、红景天饮片，加入适量乙醇，浸泡4 h后回流提取，合并滤液，滤液过滤定容，摇匀取样，平行3次，将样品稀释，微孔滤膜(0.45μm)滤过，备用。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷、红景天苷对照品适量至容量瓶中，分别加甲醇溶解，制成每毫升含有红景天苷0.506 mg、芍药苷0.543 mg的混合对照品溶液。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取混合对照 品溶液(红景天苷506 μg·mL-1，芍药苷543 μg·mL-1)2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进样测定。以峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得红景天、芍药苷回归方程分别为Y=3 164.7X-3 999.3 (r=0.999 8)；Y=2 884.6X+2 000.0 (r=0.999 8)。结果表明，红景天苷在50.6～354.2 μg·mL-1、芍药苷在54.3～380.1 μg·mL-1线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10 μL，重复进样6次，依法测定，结果芍药苷、红景天苷峰面积RSD分别为1.62%、1.09%，表明精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取星点试验下6号样品储备液，过0.45 μm微孔滤膜，在0～12 h内每2 h进样1次，按上述色谱条件测定。结果各成分峰面积RSD均小于5(n=6)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.7 加样回收率试验 精密量取星点试验下6号样品储备液，计算加入等量待测物质的对照品溶液，按上述色谱条件下测定，计算芍药苷和红景天苷的加样回收率。结果平均回收率均在95%～105%，RSD均小于5(n=6)。

2.2 星点设计试验

2.2.1 因素、水平及指标的确定 影响醇提工艺主要因素有乙醇浓度(X1)、乙醇用量(X2)、提取时间(X3)、提取次数、药材粒度，由于提取次数、药材粒度为非连续性变量，不能进行回归处理，结合预试验单因素考察结果及工业生产实际，确定提取次数为2次，药材粒度为中药饮片；其余因素、水平见表1。

表1 星点设计因素与水平

2.2.2 试验安排与指标测定 按星点设计3因素设计试验，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，以总皂苷含量、芍药苷含量、红景天苷含量、浸出物量综合评分为考察指标，星点试验结果见表2。

表2 星点设计与结果

2.2.3 结果分析 指标权重的确定：以总皂苷含量、红景天苷含量、芍药苷含量和浸出物量为指标综合评价(权重系数分别为0.3、0.3、0.3、0.1)。

综合评分=(总皂苷含量/最大总皂苷含量)×30%+(红景天苷含量/最大红景天苷含量)×30%+(芍药苷含量/最大芍药苷含量)×30%+(醇浸出物得率/最大醇浸出物得率)×10%

模型拟合：采用Design-Expert8.0.5b软件对综合评分进行多元线性回归，结果r=0.058 5，相关系数较低，拟合度不佳，预测性较差，因此线性模型不适合，故采用二项式拟合，得到回归方程：Y=-366.914 45+13.593 23X1+1.282 1X2+24.345 8X3+0.050 735X1X2-0.217 08X1X3-0.972 27X2X3-0.107 24X12-0.151 06X22-0.136 97X32(r=0.972 0)，比较线性回归与二次多项式拟合的结果可知，二次多项式表现出更好的相关性。

方差分析：采用ANOVA分析效应面的回归参数，方差分析结果见表3。

表3 二项式模型及方差分析

方差分析结果显示，该二项式拟合模型F值为38.51，P﹤0.000 1，表明建立的模型具有统计学意义；确定系数Radj2为0.946 7，说明方程的因变量与全体自变量之间的线性关系是显著的，响应值的变化有94.67%来源于本研究所选定的自变量。模型的变异系数为0.88%，说明该模型的精度很好。同时，方程的失拟项不显著，回归方程在整个回归区域内拟合情况良好，可用该回归模型代替真实试验点对结果进行分析。表3显示，各因素对响应值作用的显著性排序为X1>X2>X3。二次项X12对指标影响显著。以上结果印证了芪天颗粒提取模型中各因素对考察指标的影响并不是简单的线性关系。

等高线图和效应面图分析：对拟合的模型进行适合性检验，以通过检验的合适的数学模型为基础，描绘三维效应面，由于三维效应面只能表达含2个自变量函数的曲面图，因此固定3个自变量中的1个，并设其值为中值，代入原方程，应用Design-Expert8.0.5b统计软件绘制三维曲面图及等高线图，见图1～3。从图中还可以看出，每个效应面都具有各自的较优区域，通过效应面图及等高线叠加区域，得出较佳工艺范围为X1：59.05%～70.95%；X2：8.81倍～11.19倍；X3：1.20～1.80 h；结合实际生产条件，最终确定工艺为加10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

图1 乙醇用量、乙醇浓度及其相互作用对提取 工艺影响的响应面

图2 提取时间、乙醇浓度及其相互作用对提取 工艺影响的响应面

图3 提取时间、乙醇用量及其相互作用对提取 工艺影响的响应面

验证试验：根据最优工艺制备3批样品，测定其总皂苷、芍药苷、红景天苷含量和浸出物量，结果总皂苷平均含量为26.16 mg·g-1、芍药苷平均含量为30.67 mg·g-1、红景天苷平均含量为9.58 mg·g-1，醇浸出物量29.81%，总评归一值0.921 3，预测值0.915 8，偏差率为-0.60%，说明本试验建立的数学模型可靠，具有良好的预测性。

3 讨论

目前国内中药提取工艺优化的相关报道多采用正交设计法，是采用线性模型。正交设计法具有试验次数少、简单方便等优点，但是，也有其缺点，即没有直观图形，无法直观判别优化区域，因此，预测性较差。星点设计—效应面法是近年来在优化中药提取工艺方面应用十分广泛的一种方法[4-6]。适用于非线性拟合，具有实验次数少、精密度高、预测性好等优点[7]。本实验在单因素试验的基础上，采用星点设计—效应面法优选工艺，其结果更具可靠性。以拟合的二次方程为模型，得出总评OD值的预测值为0.213，经过3次验证试验，得到总评OD值的平均值为0.915 8，偏差率为-0.60%，表明星点设计—效应面法优化本方的工艺预测性较好。

笔者以多指标成分综合评分作为评价指标，优化了芪天颗粒醇提工艺。最终确定醇提最佳工艺：10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。分析结果得乙醇浓度、乙醇用量和提取时间对综合评分有不同程度的影响，其中乙醇浓度影响最显著，各因素间存在不同程度的交互作用。星点设计的理论优化结果与试验值差异小，采用非线性拟合模型接近客观事实，效应面三维图使因素对指标的影响更为直观、方便，精度高。本实验优化出了本方醇提的最佳工艺，为下一步的制剂成型奠定了基础。

[1] 刘德丽，包华音，刘杨.近5年黄芪化学成分及药理作用研究进展[J].食品与药品，2014，16(1)：68.

[2] 陆小华，马骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2015，46(4)：5955.

[3] 赵慧，孙长山，贾凌云，等.正交试验优选红景天的提取工艺[J].中成药，2005，27(11)：1344.

[4] 汪晶，吴晓燕，狄留庆.星点设计-效应面法优选凉血通瘀颗粒醇提工艺[J].南京中医药大学学报，2012，28(2)：169.

[5] 卢君蓉，傅超美，刘芳，等.星点设计-效应面法优选丹参中丹参总酚酸的提取工艺[J].中成药，2012，34(7)：1373.

[6] 杨秀梅，黄勤挽，欧小群，等.星点设计-效应面法优化加味圣愈汤的水提工艺[J].中药与临床，2014，5(5)：13.

[7] 吴伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用[J].国外医学·药学分册，2000，27(5)：292.

OptimizationofAlcoholExtractingProcessBasedonCentralCompositeDesignandResponseSurfaceMethodologyforQitianGranules

HE Chenghui1，LIU Xuanlin1，Gulisitan·AWUTI1，XING Jianguo1*，WANG Qiaomei2

(1.XinjiangInstituteofMateriaMedica，Urumqi830004，China；2.ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

Objective：To optimize the alcohol extraction process for Qitian Granules by central composite design and response surface methodology.Methods：Central composite design and response surface methodology were used to optimize the alcohol extracting process.The main influentia1 factors of extraction efficiency were ethanol concentration，reflux time，and solvent ratio.The conditions of the extraction were evaluated by the two compositions of paeoniflorin and salidroside.Multiple linear regression and binomial fitting models were performed with the main influential factors.Response surface and superposition of contour line were used to optimize the process and to predict the response in the optimal region.Results：The analysis indicated the optimum conditions of the extracting were 60% ethanol，10 fold solvent，extracting for 2 times and for 1.5 h.Conclusion：It shows that the optimum process for extracting is simple，more convenient and with an higher precision，which is significant to industry production.

Central composite design；Qitian Granules；paeoniflorin；salidroside；extraction process；response surface

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.019

2016-01-22)

新疆地产中药民族药新药研发项目(Q2015-01-03)

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邢建国，研究员，研究方向：中药制剂研究；Tel：(0991)2300682，E-mail：xjguodd@163.com