多重耐药铜绿假单胞菌的耐药基因分析

朱葵向，金妙玲

多重耐药铜绿假单胞菌的耐药基因分析

朱葵向，金妙玲

目的探讨多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及其相关的耐药基因。方法采用肉汤稀释药敏板法测定56株铜绿假单胞菌对21种抗菌药物的敏感性，同时采用聚合酶链反应法（PCR）检测56株铜绿假单胞菌的相关耐药基因及外膜通道蛋白oprD2基因。结果56株多重耐药铜绿假单胞菌对头孢他啶、氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、复方磺胺甲恶唑、复方新诺明、环丙沙星、妥布霉素、替卡西林及头孢唑林耐药率为100.0%，头孢呋辛的耐药率为94.6%，亚胺培南的耐药率为89.3%，美罗培南的耐药率为83.9%；耐药基因检测阳性率最高的是膜通道蛋白oprD2基因，阳性率为92.9%。结论多重耐药铜绿假单胞菌存在耐药基因，A类与D 类 -内酰胺酶基因的存在使得其对头孢菌素产生耐药，对亚胺培南产生耐药主要与oprD2基因的存在有关。

铜绿假单胞菌；微生物敏感性试验；多重耐药；基因

铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰阴性杆菌，是皮肤软组织、呼吸道和医院内等感染最常见的条件致病菌。近年来，由于广泛过度使用 -内酰胺类抗生素、碳青酶烯酶的产生及广泛开展各种有创诊疗操作，使得铜绿假单胞菌的耐药性不断上升，其对抗菌药物的耐药机制包括多种 -内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶的产生、外膜通道蛋白D2（OprD2）的缺失、外排泵及靶向突变等[1]。多重耐药铜绿假单胞菌菌株的出现，不仅使临床上的抗感染治疗面临诸多困难和挑战，而且也容易导致医院暴发和流行大规模的感染[2]。本研究旨在探讨分析临床上分离出的多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及其相关的耐药基因，为临床上进一步合理应用抗菌药物提供科学依据，报道如下。

1　资料与方法

1.1菌株来源选取2014年6月至2015年6月浙江省浦江县人民医院分离并鉴定的铜绿假单胞菌56株，均来自于住院患者的痰液、尿液及伤口分泌物等各类标本。质控菌株购自卫生部临床检验中心，包括：铜绿假单胞菌（ATCC27853）、大肠埃希（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）。

1.2药敏实验采用肉汤稀释药敏板法测定56株铜绿假单胞菌对21种抗菌药物的敏感性，判断标准为CLSI2009。21种抗菌药物均为为英国OXOID公司产品。1.3仪器与试剂采用聚合酶链反应法（PCR）检测56株铜绿假单胞菌的相关耐药基因及外膜通道蛋白 oprD2基因，PCR仪为AB stepone real-time PCR system，所需要的引物委托上海生工生物技术有限责任有限公司进行合成；所需要的Taq酶、PCR试剂及DNA标志物购买于Fermentas公司。

1.4耐药基因检测挑纯培养菌落置入0.5 ml离心管内（内已预置200 ng/ml蛋白酶K溶液）。56℃水浴2h，改95℃水浴10 min。15 000 r/min离心30 s，移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液置入―20℃冰箱备用。采用PCR扩增，按常规方法建立PCR体系，PCR引物序列见文献[2-3]。PCR扩增产物送上海生工生物技术有限责任有限公司进行DNA双向序列测定。

2　结果

2.1多重耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的药敏率56株多重耐药铜绿假单胞菌对头孢他啶、氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、复方磺胺甲恶唑、复方新诺明、环丙沙星、妥布霉素、替卡西林、头孢唑林耐药率为100.0%，头孢呋辛的耐药率为94.6%，亚胺培南的耐药率为89.3%，美罗培南的耐药率为83.9%，见表1。

表1　56株多重耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的药敏率　株（%）

2.2多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因检测56株多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因检测阳性率最高的是膜通道蛋白oprD2基因，阳性率为92.9%，见表2。

表2　56株多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因检测阳性率

3　讨论

近年来，临床上广泛使用广谱抗菌药物，使得铜绿假单胞菌耐药性越来越严重，尤其是多重耐药菌株的出现，给临床抗感染治疗和控制医院内感染带来了巨大的困难。所以，对医院多重耐药铜绿假单胞菌菌株的耐药基因情况进行充分的了解，分析其耐药机制，对临床用药的指导及医院感染的控制具有重大的意义[3-4]。

目前，治疗铜绿假单胞菌感染最主要的一类抗菌药物为 -内酰胺类，随着临床上对其大规模使用，铜绿假单胞菌对其耐药性日益显现，大多是在抗菌药物治疗过程中获得或者相应基因表达发生改变而出现继发耐药。主要的耐药机制为产生了 -内酰胺酶和外膜蛋白oprD2表达减弱或缺失。外膜蛋白oprD2是亚胺培南进入菌体特异性通道，如果菌株存在膜通道蛋白oprD2基因，就会抑制 oprD2蛋白的生物活性甚至导致oprD2蛋白缺损，从而对亚胺培南表现耐药。本研究显示，膜通道蛋白oprD2基因检测的阳性率为92.9%，与亚胺培南耐药率89.3%比较接近，表现为基因型与表型的相对一致，所以oprD2基因的存在是铜绿假单胞菌对亚胺培南抗菌药物耐药的主要原因。亚胺培南与美罗培南两者似乎不存在交叉耐药，其原因可能与美罗培南不通过oprD2进入细菌胞内有关。但是，由于美罗培南是铜绿假单胞菌主动外排系统 MexAB-OprM的底物，本研究的耐药率达83.9%，存在继发耐药的可能[5-6]。

综上所述，对多重耐药铜绿假单胞菌产酶机制和耐药机制进行深入了解和研究，加强对其耐药性的常规监测，将有助于制定科学的治疗方案，对临床用药的指导及医院感染的控制具有重大的现实意义。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.02.039

R446.5

A

1671-0800(2016)02-0215-02

2015-10-10

（本文编辑：孙海儿）

322200浙江省浦江，浦江县人民医院

朱葵向，Email:Zhukx 1971@126.com