超临界CO2流体萃取兔肉腥味物质

谢跃杰，贺稚非，李洪军

（西南大学食品科学学院/重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）

超临界CO2流体萃取兔肉腥味物质

谢跃杰，贺稚非，李洪军

（西南大学食品科学学院/重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）

【目的】探讨超临界CO2流体（SFE-CO2）萃取兔肉腥味物质的条件，确定腥味物质的种类、组成和含量，为兔肉脱腥以及加工提供理论基础。【方法】采用超临界CO2流体对兔肉腥味物质进行萃取，以提取率为指标，在单因素试验基础上进行Box-Behnken响应面分析；定量加入内标物质2，4，6-三甲基吡啶（TMP），通过气相色谱质谱仪（GC-MS）对兔肉腥味物质进行分析鉴定。计算气味活度值（OAV），结合气相色谱-嗅闻（GC-O）和感官评价，确定兔肉腥味物质主体成分。【结果】单因素试验结果表明，当萃取温度为40℃时，提取率最高达到97.91%，峰面积为1.58×109；当萃取时间为4 h时，提取率最高，为97.83%，峰面积为2.42×109；萃取压力为25 MPa时，最高提取率为97.78%，峰面积3.78×108。其中，萃取温度和萃取压力不仅影响溶质扩散系数，还影响CO2流体密度。温度增加时，尽管扩散系数增大，由于 CO2流体密度下降，提取率随之减小。虽然 CO2流体密度在高压下较大，但随着压力增加，可压缩性随之减小，由于扩散系数降低，溶质溶解度下降，因而提取率降低。当萃取时间过长时，一些非挥发性物质被溶出，使得萃取物质总量增加，降低了挥发性风味物质的比重。根据响应面分析，得出最优萃取条件为：萃取温度40.67℃、萃取压力25.67 MPa、萃取时间3.13 h，提取率为98.01%。而实际操作时，提取条件修正为萃取温度40℃、萃取压力25 MPa、萃取时间3 h，在此条件下提取率为98.11%。通过定量加入内标物质TMP，GC-MS定性定量分析得到兔肉挥发性风味物质5类，包括醛类、酸类、酯类、杂环类化合物和烃类，共计38种风味化合物。其中，酸类（（1 394.25±3.45）μg·kg-1）＞酯类（（569.26±1.23）μg·kg-1）＞烃类（（471.82±1.11）μg·kg-1）＞醛类（（168.46±0.97）μg·kg-1）＞杂环类（（86.71±0.64）μg·kg-1）。通过计算得到兔肉挥发性风味物质中戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃的OAV值均大于1，且己酸＞己醛＞2-戊基-呋喃＞戊醛，表明这4种物质对兔肉腥味有重要贡献，而己酸对兔肉腥味的贡献最大。同时，气相色谱-嗅闻（GC-O）分析认为这4种物质均具有不同程度异味，包括肝脏腥味、草腥味、羊膻味和豆腥味等，感官分析表明萃取物有明显兔肉腥味。【结论】超临界 CO2流体萃取兔肉腥味物质可行，为研究兔肉腥味提供了新的提取方法。其最佳萃取条件为：时间3 h，温度40℃，压力25 MPa。戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃初步确定为兔肉腥味的主体成分。

兔肉；腥味；超临界CO2流体萃取（SFE-CO2）；气相色谱-质谱（GC-MS）；气味活度值（OAV）；感官评价

0　引言

【研究意义】根据FAO统计，2013年中国家兔和野兔存栏共计2.3亿只，兔肉产量约73万t，是第二大兔肉生产国意大利产量的近3倍［1］。兔肉作为“高蛋白、高赖氨酸、高磷脂、高消化率”和“低脂肪、低热量、低胆固醇、低尿胺”的功能性肉制品，本应成为大众消费品［2］。但是，兔肉腥味影响了国人对兔肉的消费，中国兔肉人均年消费仅为0.55 kg，欧盟国家人均消费3.5 kg，而意大利则达到4.33 kg［3］。兔肉腥味，是指兔肉在加热后所产生的一种令人嫌忌的特殊气味［4］。不同国家、民族和个体对此气味的敏感程度不同，适应接受度也不同。在中国，大部分人认为兔肉是有腥味的［5］。由于烹饪的原因，主要消费群体集中在川渝两地。因此，研究兔肉腥味物质对兔产业发展尤为重要。【前人研究进展】目前，对兔肉挥发性风味物质提取的研究主要是同时蒸馏萃取法（SDE）和固相微萃取法（SPME），研究主要集中在风味物质的种类和数量，对于兔肉主体风味物质的认定还不明确［6-7］。SDE和 SPME都是在沸腾或者接近沸腾的温度下进行提取，风味物质可能受到高温的影响而发生降解、氧化或与其他物质进行反应。据实际调查发现，兔肉腥味往往在低温或室温时更强烈。【本研究切入点】由于超临界CO2流体萃取（SFE-CO2）技术中CO2的临界温度接近室温（31.1℃），临界压力7.38 MPa，对易挥发性和生理活性物质的损失和破坏极小，且适用于亲脂性、分子量较小物质的萃取［8］。此技术常用于精油物质的提取［9-11］，而针对肉类风味方面的研究则较少［12-13］。因此，本试验采用SFE-CO2萃取兔肉挥发性风味物质，运用气味活度值法（OAV），通过气相色谱串联质谱（GC-MS）分析，对兔肉腥味物质进行定量定性研究。【拟解决的关键问题】确定SFE-CO2萃取兔肉腥味物质的条件，明确兔肉腥味物质的组成和成分，为进一步研究兔肉脱腥奠定基础。

1　材料与方法

试验于2015年9—11月在西南大学食品科学学院和重庆市食品药品检验检测研究院进行。

1.1 材料与试剂

兔肉：75日龄的伊拉兔10只，伊拉兔的养殖地点为西南大学动物科技学院养殖场。宰杀于实验兔场，经胴体分割，于-20℃冷冻保存；2，4，6-三甲基吡啶（TMP）标准品、戊醛、己醛、己酸、2-戊基-呋喃、2，4-癸二烯醛、2-癸烯醛，均为色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司生产。

1.2 仪器与设备

QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；气相色谱-嗅辨仪，日本岛津公司&瑞士 Brechbuehler公司；N-EVAP系列24位氮吹仪，美国Organomation公司；DW-86W100超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；Hei-VAP Adventage旋转蒸发仪，德国Heidoph公司；SFE-4超临界二氧化碳萃取仪，德国Applied Separations公司；JYL-C020厨房机械料理机，中国Joyoung公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 将冷冻兔肉置于 4℃的冷藏箱里过夜解冻，然后将其置于室温下待用。将解冻后的兔肉切成1 cm×1 cm×1 cm的肉丁，置于家用搅拌机里绞碎，随后取出密封、冷藏备用。

1.3.2 SFE-CO2单因素试验［14］称取绞碎兔肉样品30 g，放入超临界二氧化碳流体萃取釜中，聚丙烯羊绒填充夯实。萃取温度分别为：35、40、45、50和55℃，此时萃取时间和萃取压力分别为3 h和20 MPa；萃取时间分别为：1、2、3、4和5 h，此时萃取温度和萃取压力分别为45℃和20 MPa；萃取压力分别为：10、15、20、25和30 MPa，此时萃取温度和萃取时间分别为45℃和3 h。将提取到的液体旋转蒸发浓缩至1 mL，定量加入TMP 10 μL，0.45 μm有机滤膜过滤备用。

1.3.3 SFE-CO2响应面分析试验 根据 Box-Behnken中心设计原理，以萃取温度、萃取压力和萃取时间 3因素为自变量，并以-1、0、+1分别代表自变量的低、中和高水平，设计3因素3水平试验，试验因素水平设计见表1，以提取率Y为响应值进行响应面试验。

1.3.4 GC-MS分析［15］色谱柱：J&W DB-5ms石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口温度250℃；升温程序：40℃保持1 min，以8 ℃·min-1升至180℃，保持3 min；载气（He）流速1.1 mL·min-1，压力2.4 kPa，进样量1 µL；分流比：10∶1。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250℃；离子源温度250℃；检测器电压350 V；质量扫描范围（m/z）35—400。

表1　响应面试验因素水平表Table 1 Level of factors in the response surface design

定性分析：参考各种化合物的保留时间，并且与计算机自带数据库（NIST）检索匹配，相似度大于80%的化合物被认定，反之则否定。

定量分析：各挥发性化合物的相对含量即为各峰面积的百分比，各种挥发性风味化合物的绝对含量计算公式如下：

式中：MC为化合物绝对含量（μg·kg-1），As为总离子流图中化合物峰面积，AI为内标物质峰面积，CTMP为TMP浓度（μg·mL-1），VTMP为内标物加入的体积（mL），MS为肉样品重量（g）。

1.3.5 OAV分析［16］气味活度值（VOA）=气味物质浓度（C）/阈值（T）；气味物质浓度，即1.3.4测得各化合物绝对含量；阈值，即各化合物的嗅闻阈值。当OAV≥1时，认为此物质对总体风味有重要贡献；反之，当OAV＜1时，认为此物质对总体风味无贡献。1.3.6 GC-O分析 参考GC-MS的仪器参数条件，感官嗅闻。

1.3.7 统计分析 利用SPSS22.0统计软件对试验数据进行方差分析，Excel 2010计算平均值和标准偏差，Origin8.1软件作图。

2　结果

2.1 SFE-CO2萃取单因素试验

2.1.1 萃取温度对提取率的影响 由图1可以看出，无论是峰面积还是提取效率都随着提取温度增加呈先上升，再下降的趋势。萃取温度40℃时，提取率可达到97.91%。低于此温度时，虽然CO2密度稍有减小，但增加了溶质扩散系数，因此温度增加，萃取物质的量增加；高于此温度时，虽然扩散系数增大，但CO2密度下降较大，因此提取到的物质总量减少。由此可见，萃取温度40℃为临界点，是最佳提取温度。

2.1.2 萃取时间对提取率的影响 由图2可以看出，萃取时间为4 h时，无论是峰面积还是提取效率都最高。随着萃取时间延长，提取率呈上升趋势，4 h的提取率则达到 97.83%。而萃取物峰面积则先下降后上升，4 h的峰面积几乎是3 h的3倍。明显看出，萃取时间为4 h时，提取效果最佳。萃取时间超过4 h，提取率反而下降，说明此时有些物质之间相互发生了反应，或者一些物质浓度较低，没法检出，也有可能是一些非挥发性成分溶出。

图1　超临界二氧化碳流体萃取温度对提取率的影响Fig. 1 The effect of extraction temperature on the extraction rate by SFE-CO2

图2　超临界二氧化碳流体萃取时间对提取率的影响Fig. 2 The effect of extraction time on the extraction rate by SFE-CO2

2.1.3萃取压力对提取率的影响 经GC-MS分析，如图3所示，萃取压力为15 MPa时，峰面积最大。随着提取压力增大，峰面积呈减小的趋势。这与在一定温度下，压力与扩散系数成反比的原理一致。而萃取压力为25 MPa时，提取效率最高，达到97.78%。大于这个压力时，提取效率反而下降。说明此压力为萃取临界压力，由于在高压下CO2密度较大，可压缩性也较小，增加萃取压力，反而降低了扩散系数，减少了对溶质的溶解度，进而降低了萃取效率。低于此压力时，虽然萃取量不少，但提取效率不高［17］。因此，25 MPa是最佳萃取压力。

2.2 SFE-CO2萃取条件响应面分析试验

利用Design Expert7.0 软件对表2数据进行多元回归拟合，得到提取率（Y）对萃取温度（A）、萃取压力（B）和萃取时间（C）的二次多项回归模型，回归 方 程 为 ： Y=97.9+0.29A+0.39B+1.32C+0.23AB-0.1AC-0.15BC-0.44A2-1.59B2-0.76C2。对回归模型各因素进行方差分析，结果见表3。

图3　超临界二氧化碳流体萃取压力对提取率的影响Fig. 3 The effect of extraction pressure on the extraction rate by SFE-CO2

对回归方程进行显著性检验：F=50.79，P＜0.0001，极显著，相关系数R2= 0.9975，R2Adj=0.9943，失拟项P=0.0897＞0.05，不显著，说明模型与实际值拟合良好。可用此模型研究不同萃取条件对兔肉挥发性物质提取率的影响，优化响应因子水平。由表3可知，3个因素中，模型的一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2对提取率的影响显著，A、B和B、C之间交互作用显著，但A、C之间交互作用不显著。从方差分析可以看出，对提取率的影响为萃取时间＞萃取压力＞萃取温度。

根据响应面分析，得到最佳的萃取温度40.67℃、萃取压力25.67 MPa、萃取时间3.13 h。根据实际操作，提取条件修正为萃取温度40℃、萃取压力25 MPa、萃取时间3 h，在此条件下提取率为98.11%，高于表2中的最高值98.01%。因此，认为该模型适用于优化提取工艺参数。

2.3 GC-MS分析

超临界二氧化碳流体提取兔肉挥发性风味物质如图4。通过谱库检索，一共鉴定到38种挥发性风味物质，见表 4。通过内标物计算得到每种物质的浓度，其中烃类（471.82±1.11）μg·kg-1、醛类（168.46±0.97）μg·kg-1、酸类（1 394.25±3.45）μg·kg-1、酯类（569.26± 1.23）μg·kg-1和杂环类（86.71±0.64）μg·kg-1。可以看出，酸类含量最高，主要是己酸、壬酸、辛酸、棕榈酸等。其中己酸、辛酸被描述为具有羊膻味的物质，而壬酸、棕榈酸则不具有挥发性。因此，己酸、辛酸可能对兔肉腥味有重要影响。酯类物质也是风味成分中很重要的一类，特别是酒类和水果中含量较高。但此处多是一些不具挥发性的酯类，对风味的贡献不大。烃类物质是含量第三高的一类，但烃类物质的感官阈值通常较高，因此，虽然含量较高，但是它也并不是对兔肉腥味贡献较大的一类。杂环类只检测到2-戊基-呋喃和2-辛基-呋喃两种。有学者认为2-戊基-呋喃和戊醛与腐臭味有较强的相关性［18］。而醛类物质含量较低，总共只有（168.46±0.97）μg·kg-1。由于醛类物质的感官阈值通常较低，因此，即便是较低含量也能产生足够强的风味，对兔肉腥味的影响较大。

表2　Box-Behnken设计表及试验结果Table 2 Design of Box-Behnken and experimental data

表3　响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表4　兔肉SFE-CO2提取物GC-MS分析结果Table 4 Volatile compound in rabbit meat extracted by SFE-CO2

图4　超临界二氧化碳流体萃取兔肉挥发性风味物质GC-MS图Fig. 4 The gas chromatography mass spectrum of rabbit meat volatile flavor compounds extracted by SFE-CO2

2.4 兔肉腥味主体成分分析

采用SFE-CO2提取到兔肉中的大约38种挥发性风味物质，每种物质有不同的感官阈值和各自的特征风味。本试验萃取物经过GC-O感官分析，萃取物能嗅闻到油脂味、纸板味、蘑菇味、金属味、青草味、豆腥味、泥土味等，总体呈现强烈的不愉悦兔肉腥味。由于挥发性风味物质是由不同物质组成，而每种物质对整体风味的贡献不同。因此，采用香气活度值法计算各物质的OAV值，可以知道各种物质对总体风味的贡献程度。只有当OAV值≥1时，表明此物质对总体风味有影响［19］。如表5所示，兔肉采用SFE-CO2法提取到的风味物质中，戊醛、己醛、己酸和 2-戊基-呋喃为主体风味物质。除己酸和2-戊基-呋喃以外，与之前研究兔肉风味报道中提到的中级醛类为主体风味大体一致［20-21］。

表5　兔肉腥味主体成分Table 5 Main bodies of odor in rabbit meat

3　讨论

3.1 SFE-CO2萃取条件对兔肉腥味萃取效果的影响

众所周知，超临界流体萃取是研究风味物质的有效方法之一［27］。其密度与液体接近，而又有较高的传质性和流动性，因此，其萃取能力既接近液体，又近似于气体。在合适的温度和压力下，能提供足够的密度来实现较强的溶解能力［28］。在诸多的超临界流体中，CO2最受人青睐，主要是因为其临界温度接近室温，对易挥发性或生理活性物质极少损失和破坏。特别适合于天然活性物质成分的萃取分离［29］。除此之外，安全无毒、化学惰性、腐蚀性小、廉价易得等特点使得 CO2成为一种绿色环保的萃取介质。由于SFE-CO2操作相对简单，萃取条件主要为：萃取温度、萃取压力和萃取时间。试验结果可以看出，萃取压力25 MPa，萃取温度40℃，萃取时间3 h时，萃取效果最佳。这和其他一些采用SFE-CO2研究挥发性风味物质试验时的萃取条件相似，但也略有不同［30-31］。可能是因为一些挥发性物质的性质相似。同时，仪器的使用范围有限，例如萃取压力。即便如此，萃取压力、萃取温度等条件的改变，的确能左右最终的萃取效果。因此，本研究也初步探索了SFE-CO2萃取条件对兔肉腥味的萃取效果。

3.2 SFE-CO2对兔肉腥味物质的萃取分析

SFE-CO2一般用于精油、香辛料等物质的萃取，且萃取效果较好。其用于肉风味物质的研究的确较少，仅国外有些相关研究［13］。与同时蒸馏萃取、固相微萃取相比，SFE-CO2虽然萃取种类和含量不如前二者［32］。但是，感官嗅闻表明，此萃取方法得到的萃取物更接近真实的兔肉腥味。原因可能是，同时蒸馏萃取几乎是在沸腾状态下进行提取，而固相微萃取的萃取条件根据针头涂层的性质和厚度有所不同，SFE-CO2法在较低温度下进行了兔肉腥味的提取，避免了高温氧化、热降解和掩盖等一系列作用，得到了一些对热不稳定，非极性脂溶性的小分子醇、醛和酸类物质，特别是酸类物质显著增加。因此，可以设想兔肉腥味物质与某种或者几种酸类物质相关，这也为后续进一步研究兔肉腥味提供了参考。

3.3 兔肉腥味主体成分的确定

目前，对主体风味物质的研究主要依靠OAV法和香味提取物稀释分析法（AEDA）［33-34］。AEDA法是在确定的几种风味物质里，根据不同稀释浓度观察不同物质对风味的贡献程度，一般用于主体成分已经确定之后的进一步研究。而OAV法则是通过计算试验中各物质的香气活度值来确定主体成分，与AEDA法相比，OAV法更适合样品主体风味成分未知时的分析研究。本研究采用 OAV法，对兔肉挥发性风味物质进行筛选，得到戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃这4种物质的浓度大于其感官阈值，即 OAV＞1，说明这4种化合物对兔肉腥味有重大贡献。戊醛、己醛作为异味物质已经存在于前人的报道中［6］，2-戊基-呋喃也被初步认定对兔肉腥味有影响［35］，而己酸作为兔肉腥味则未见报道，这也正是本研究新发现之一。当然，对于己酸作为兔肉腥味物质也需更深入的研究。

4　结论

超临界CO2流体萃取兔肉腥味物质，得到超临界萃取最佳时间为3 h，最佳萃取温度为40℃，最佳萃取压力为25 MPa，提取率达98.11%；超临界CO2流体萃取可有效用于兔肉腥味物质的提取。通过定量加入内标物质 TMP，经气相色谱串联质谱进行分析鉴定，SFE-CO2法能萃取到兔肉中 38种挥发性风味物质，其中戊醛、己醛、己酸和2-戊基-呋喃认定为兔肉腥味主体成分，感官分析表明，超临界CO2流体萃取物确实有明显的兔肉腥味。

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（责任编辑 赵伶俐）

The Odor of Rabbit Meat Extracted by Supercritical Carbon Dioxide Fluid Extraction

XIE Yue-jie， HE Zhi-fei， LI Hong-jun
（College of Food Science， Southwest University/Chongqing Special of Food Engineering Technology Research Center，Chongqing 400715）

【Objective】The aim of this study was to explore the conditions for extracting the odor of rabbit meat by supercritical carbon dioxide fluid extraction （SFE-CO2）， to determine the species， components and contents of rabbit meat odor and to provide thedatabase for further deodorization and processing industry. 【Method】 SFE-CO2technology was employed to extract the odorants in rabbit meat with Box-Behnken response surface analysis based on single factor experiments， using extraction yield as a target. The odorants of rabbit meat were detected by gas chromatograph in tandem with mass spectrum， with 2， 4， 6-trimethylpyridine （TMP） as an internal standard. Calculating odor active value （OAV） of the detected matters， and combining with gas chromatography olfactory （GC-O） and sensory evaluation， the main contents of rabbit meat odor was determined.【Result】The results of single factor experiment indicated that the extraction yield could reach 97.91% and the peak areas were 1.58×109when the extraction temperature was 40℃. When the extraction time was 4 hours， the extraction yield and peak areas were 97.83% and 2.42×109， respectively. The extraction rate reached 97.78% with peak areas of 3.78×108when the extraction pressure was 25 MPa. Among the three factors， the extraction temperature and extraction pressure not only affected the solute diffusion coefficient， but also the density of CO2fluid. The diffusion coefficient increased when the extraction temperature was raised， but the extraction yield decreased due to the decreased CO2fluid density. Although the density of CO2fluid was larger at higher extraction pressure， the compressibility decreased. Hence，the extraction yield decreased due to the reduction of diffusion coefficient and solubility. When the extraction time was too long， the proportion of the odorants was reduced， for some non-volatile compounds were extracted， with the total amount increased. According to the response surface analysis， it was concluded that the optimal extraction temperature， extraction pressure and extraction time were 40.67℃， 25.67 MPa and 3.13 h， respectively， with extraction yield reached 98.01%. And the actual operation showed that the extraction temperature， extraction pressure and extraction time were 40℃， 25 MPa and 3 h， respectively. Under these conditions， the extraction yield was 98.11%. Through quantitatively adding internal standard substance TMP， GC - MS quantitatively analyzed for rabbit meat volatile flavour compounds of five classes， including aldehydes， acids， esters， heterocyclic compounds and hydrocarbons，a total of 38 kinds of flavor compounds. Comparing the five types of matter content： acids （（1 394.25±3.45） μg·kg-1） ＞ esters（（569.26±1.23） μg·kg-1） ＞ hydrocarbon （（471.82±1.11） μg·kg-1） ＞ aldehyde （（168.46±0.97） μg·kg-1） ＞ heterocyclic （（86.71±0.64）μg·kg-1）. The key odorants of rabbit meat odor were pentanal， hexanal， hexanoic acid and 2-pentyl furan via calculating OAV. Those four materials with liver off-flavor， grass odor， muttony odor and beany odor respectively were regarded as the main bodies of odor in rabbit meat by GC-O. In addition， the extractant showed rabbit meat odor obviously through sensory evaluation.【Conclusion】The method of SFE-CO2which provides a new extraction way for researching rabbit meat odor is feasible. The optimal extraction temperature， extraction time and extraction pressure was 40℃， 3 h， 25 MPa. Pentanal， hexanal， hexanoic acid and 2-pentyl furan were preliminarily regarded as the main bodies of rabbit meat odor.

rabbit meat； odor； supercritical carbon dioxide fluid extraction （SFE-CO2）； gas chromatography mass spectrum （GC-MS）； odor active value （OAV）； sensory evaluation

2016-03-01；接受日期：2016-05-04

国家现代农业（兔）产业技术体系建设专项（CARS-44-D-1）、教育部兔产业体系项目（100030-40305411）、中央高校基本科研业务费专项资金（XDJK2014D042）

联系方式：谢跃杰，E-mail：yjxie@sina.com。通信作者李洪军，E-mail：983362225@qq.com