一种测定原料肉中氨含量的分光光度法

周纪东,黄黄伟,朱城杰,魏晓玲(.浙江育英职业技术学院 生物技术系,杭州 3008; .浙江两岸食品连锁有限公司,杭州 3008)

一种测定原料肉中氨含量的分光光度法

周纪东1,黄黄伟2,朱城杰1,魏晓玲2
(1.浙江育英职业技术学院 生物技术系,杭州 310018; 2.浙江两岸食品连锁有限公司,杭州 310018)

为判定原料肉的新鲜度,建立一种测定原料肉中氨含量的分光光度法.分光光度法以对羟基苯甲酸钠(PHB)为显色剂,研究原料肉中氨含量与吸光度的关系.结果表明,1.0mL肉浸液中加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸钠溶液,于37℃水浴加热30min,在695nm处测定吸光度,在0.00～20.00μg/25mL范围内氨含量与吸光度呈现出良好的线性关系.分光光度法具有较高的准确度、精确度和灵敏度,操作简单,对仪器、试剂要求不高,可作为测定原料肉新鲜度的备选方法,面向中小型肉类加工企业推广与应用.

原料肉;氨;新鲜度;分光光度法

0　引 言

肉类在贮存、运输与销售等过程中,其新鲜度极易发生变化,甚至腐败变质.因此,研究快速、简便、准确的肉类新鲜度检验技术,不仅是肉类生产加工企业和政府食品安全监管部门的迫切需求,更直接关系到广大消费者的身体健康[1].

新鲜的肉中氨含量非常低,当其腐败变质时才会产生大量氨及铵盐(合称为粗氨)等碱性含氮的特征产物,与腐败程度具有一定的相关性[2].因此,肉中粗氨含量可作为判定其新鲜度的一项重要的卫生指标.目前,肉中氨检验采用纳氏试剂进行定性判断[3],尚无准确的定量方法,而且纳氏试剂还存在成分具有毒性、配制步骤繁琐和不易存放等问题.本研究基于Berthelot反应,建立一种定量测定原料肉中氨含量的分光光度法,旨在为相关企业、监管部门判定原料肉的新鲜度提供一种新方法.

1　材料与方法

1.1反应原理

基于Berthelot反应原理,粗氨在碱性溶液中可与次氯酸盐生成氯胺,在硝普钠(亚硝基铁氰化钠)的催化下,与酚类物质反应生成蓝色的靛酚蓝染料.该物质性质稳定,而且其吸光度与样液中氨含量在一定范围内呈线性关系,故可比色测定.

1.2仪器与试剂

试验样品选用的原料肉为新鲜牛肉,取自浙江两岸食品连锁有限公司.试剂均为国产分析纯,标准物氯化铵为优级纯.溶剂用水为无氨蒸馏水.溶液有氨标准贮备液和使用液、PHB溶液、次氯酸钠溶液.氨标准贮备液:称取1.571 0g于105～110℃干燥恒重的氯化铵,加适量水溶解后移入100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀待用.此溶液每毫升相当于5 000μg的氨.氨标准使用液:临用前,准确吸取氨标准贮备液1.00mL,置于1 000mL容量瓶中,加水定容至刻度.此溶液每毫升相当于5.0μg的氨.PHB溶液:称取30.0g PHB、0.20g硝普钠溶于300mL水后过滤,滤液中加入20.0g酒石酸钾钠,溶解后加水定容至500mL,4℃保存.次氯酸钠溶液:称取20.0g氢氧化钠溶于100mL水,冷却后加入安替福民溶液2.0mL,搅匀后加水定容至200mL,4℃保存.试验使用的主要设备有:UV-1800紫外可见分光光度计(岛津企业管理(中国)有限公司)、THZ-82B气浴恒温振荡器(金坛国旺实验仪器厂)、HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司).

1.3方法

1.3.1原料肉样品处理.取适量原料肉按采样和制样要求[4]制备5份新鲜肉样,每份10.0g.其中,1份肉样立即制备肉样浸提液(简称肉浸液),编号为0,其余肉样室温放置,每隔24h取1份制备肉浸液,依次编号为1～4.10%肉浸液制备方法为1份肉样置于盛有100mL水的碘量瓶中,盖塞后不断振荡使肉样均匀分散,浸提30min后过滤,滤液置于4℃保存.

上述0～4号肉浸液按照GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[5](以下简称国标法)测定总挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量,TVB-N值分别为7.19、16.53、40.60、85.37、180.96(mg/100g).依据国家标准中TVB-N≤15mg/100g可判定为新鲜肉[6],故选择0号和1号肉浸液分别作为新鲜肉和变质肉浸液.

1.3.2分光光度法测定条件的优化.

(1)测定波长的确定.取2支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL氨标准使用液和1号肉浸液,然后2支管均依次加入2.0mL溶液、1.0mL次氯酸钠溶液,摇匀,置于35℃恒温水浴中加热20min,取出后冷却至室温,加水定容,用1cm比色皿于300～800nm区域分别扫描吸收曲线.以1.0mL蒸馏水作空白对照.

(2)反应条件的确定.准确吸取1.0mL氨标准使用液置于25mL具塞比色管中,参照(1)中步骤及在其所确定的测定波长下,分别考察P HB溶液用量、次氯酸钠溶液用量、反应温度、反应时间等单因素对吸光度的影响,据此确定最佳反应条件.

1.3.3标准曲线的建立.准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00(mL)氨标准使用液(相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0(μg)氨),分别置于10支25mL具塞比色管中,按照(2)中确定的最佳测定条件测定10支管的吸光度,以氨浓度(μg/25mL)为横坐标、吸光度为纵坐标作图绘制标准曲线.

2　结果与分析

2.1测定条件的优化

2.1.1吸收光谱与测定波长的确定.氨标准使用液和肉浸液的吸收曲线非常相似,其显色反应产物均呈现出两个明显的吸收峰,即第一个吸收峰在400nm处,根据Berthelot反应原理,推测该吸收峰是由过量的硝普钠产生的[7];第二个吸收峰在695nm处,是由显色反应产物靛酚蓝染料产生的,如图1所示.本试验选择695nm作为分光光度法的测定波长.

图1 显色反应产物的吸收曲线

2.1.2反应条件的确定.

(1)PHB溶液用量对吸光度的影响.取7支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL氨标准使用液,按照1.3.2(1)中步骤操作,其中改变7支管加入PHB溶液用量,测定波长为695nm,其余步骤条件不变,结果如图2所示.

图2　PHB溶液用量的影响

由图2可知,试剂用量在3.0～4.0mL范围内,其显色效果稳定且吸光度较大,故PHB溶液用量可取3.0mL.

(2)次氯酸钠溶液用量对吸光度的影响.取6支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL氨标准使用液,按照1.3.2(2)中步骤操作,其中改变6支管加入次氯酸钠溶液用量,测定波长为695nm,其余步骤条件不变,结果如图3所示.

图3　次氯酸钠溶液用量的影响

由图3可知,随着试剂用量递增,吸光度变化呈现出前期平稳上升,至用量为1.5mL时达到最大,其后显著下降,故次氯酸钠溶液用量可取1.5mL.

(3)反应温度对吸光度的影响.取8支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL氨标准使用液,按照1.3.2(1)中步骤操作,其中改变8支管的反应温度,测定波长为695 nm,其余步骤条件不变,结果如图4所示.

由图4可知,吸光度随着反应温度递增而发生显著变化,至37℃时达到最大值,其后逐步下降,故反应温度可设为37℃.

(4)反应时间对吸光度的影响.取6支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL氨标准使用液,按照1.3.2(1)中步骤操作,其中改变6支管的反应时间,测定波长为695 nm,其余步骤条件不变,结果如图5所示.

图4　反应温度的影响

图5　反应时间的影响

由图5可知,显色反应30min内,反应时间对吸光度显著影响,至30min时吸光度达到较大值,其后在30～60min内显色效果保持稳定,60min后吸光度趋于下降,至90min时下降显著.这表明显色反应产物在1h内稳定,考虑到测定工作效率,反应时间应选择30min为宜,并在1h内完成吸光度测定工作.

分光光度法的最佳测定条件为:25mL具塞比色管中加入1.0mL氨标准使用液,依次加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸钠溶液,充分混匀,37℃水浴加热30min,冷却至室温,在695nm处测定吸光度.

2.2标准曲线的建立

在测定波长695nm处,氨浓度在0.00～20.00 μg/25mL范围内与吸光度呈现出良好的线性关系(见图6),线性方程为y=0.0477x+0.0118(R=0.9996,n=9).肉样中氨含量C的计算公式为:

其中,C为肉样中氨含量(μg/g),A为测试液的吸光度.

由此得出,分光光度法检测肉样中氨含量的有效范围为0.00～200.00μg/g,最低检测限为1.72μg/g.

2.3精密度试验

图6　吸光度对氨浓度的标准曲线

取6支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL 1号肉浸液,按照2.1.2中确定的最佳测定条件操作,测定6支管的吸光度,结果见表1.

由表1可知,该组数据结果的相对标准偏差R S D小于1%,表明分光光度法精密度高且可靠性好.

表1　精密度试验结果

2.4回收率试验

取5支25mL具塞比色管,分别准确加入1.0mL 1号肉浸液,编号0～4,5支管分别加入0.00、0.10、0.20、0.30、0.40mL氨标准使用液(相当于0.00、0.50、1.00、1.50、2.00(μg)氨),按照2.1.2中确定的最佳测定条件操作,测定5支管的吸光度,根据标准曲线方程计算出相应的氨浓度,结果见表2.

表2　回收率试验结果

由表2可知,样品加标回收率在97.30%～106.00%之间,回收率均值接近100%,且其RSD小于5%,表明分光光度法准确度较高,测定结果可信.

2.5肉浸液放置时间的影响

将制备好的1号肉浸液常温放置,之后每隔1 h准确吸取1.0～25mL肉浸液置于具塞比色管中,按照2.1.2中步骤操作完成显色反应,测定1次吸光度,测定波长为695nm,如图7所示.

由图7可知,常温下放置超过3h,肉浸液中氨浓度开始显著增加,故制备好的肉浸液应及时开展和完成测定工作,若需延时测定,则肉浸液必须低温保存.

2.6实际样品测定与比较试验

图7 肉浸液放置时间的影响

准备5份新鲜肉样,每份10.0g,按照1.3.1中步骤操作,每隔24h取1份肉浸液,编号为0～4号.每种肉浸液均按照国标法[5]测定TVB-N含量,同时准确吸取1.0mL肉浸液置于25mL具塞比色管中,按照分光光度法测定氨含量,每次测定均做3个平行试验,结果见表3.

表3 分光光度法与国标法测定的结果比较

由表3可知,肉样放置时间与分光光度法测得的氨含量和国标法测得的TVB-N含量均呈正相关,表明分光光度法测得的氨含量可用于定量表征肉样腐败变质的变化过程.其中,肉样放置0～48h,测得氨含量小于200.00μg/g,处于分光光度法的有效测定范围内;肉样放置4 8h以上,则难以保证测定的准确度与精密度.分光光度法在准确度上可与国标法达到一致,在精密度上能超过国标法,加之相比于国标法,其操作更为简便省时,大大提高了批量检测的工作效率,故非常适用于原料肉新鲜度的快速检测,可作为国标法之外的一种备选方法.

3　结 论

本文构建的分光光度法应用于肉样中微量氨测定,可在有效测定范围内表现出较高的准确度、精密度和灵敏度,所测结果可有效判断原料肉的新鲜度.加之其对仪器、试剂要求不高,操作简单,可面向中小型肉类加工企业推广与应用,具有一定的应用前景和经济价值.

[1]张应龙,王立东,战伟伟,等.肉品新鲜度快速检测技术研究进展[J].肉类研究,2011(8):42-46.

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[5]中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.44-2003 肉与肉制品卫生标准的分析方法[S].北京:中国标准出版社,2003.

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[责任编辑:吴春琴]

A Spectrophotometry to Test Ammonia Content in Meat Used as Raw Materials

ZHOU Jidong1, HUANG Wei2, ZHU Chengjie1, WEI Xiaoling2
(1.Biotechnology Department, Zhejiang Yuying Vocational Technology College, Hangzhou, 310018, China; 2.Zhejiang Cross-straits Food Chain Co. Ltd., Hangzhou, 310018, China)

One new spectrophotometry is set up to test ammonia content in meat used as raw materials with the purpose of evaluating the freshness of the meat. By using P-hydroxybenzoic acid monosodium salt (PHB) as chromogenic agent, the relation between ammonia content and absorbance in the meat has been studied. Results show that to heat for 30minutes in water bath at 37℃, the 1.0mL of meat extract bouillon added with 3.0mL of PHB solution and 1.5mL of sodium hypochlorite solution will turn out fine linear relation between ammonia content and absorbance within 0.00～20.00μ g/25mL when absorbance is measured 695 nm away. Characterized with its high precision and accuracy, sensitiveness, being easy to operate, and low demand for instruments and reagent, the spectrophotometry can be used as an alternative for testing freshness of meat and can be introduced to small and medium meat processing enterprises and used there.

Meat used as raw materials; Ammonia; Freshness; Spectrophotometry

O657.3;TS251.7

A

1671-4326(2016)02-0060-04

10.13669/j.cnki.33-1276/z.2016.040

2016-03-28

2015年度浙江省高等学校国内访问工程师校企合作项目(137);浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)项目20(2016R453001);浙江育英职业技术学院院级课题(YYFW1501)

周纪东(1976-),男,浙江杭州人,浙江育英职业技术学院生物技术系讲师,硕士;黄伟(1976-),男,浙江金华人,浙江两岸食品连锁有限公司高级工程师,硕士;朱城杰(1993-),男,浙江萧山人,浙江育英职业技术学院生物技术系毕业生;魏晓玲(1995-),女,浙江海宁人,浙江两岸食品连锁有限公司食品检验工.