β-榄香烯对人肝癌细胞HepG2增殖的影响及机制探讨

张义敏，田明涛，李萍，唐承

(1 山东中医药大学，济南250355；2 威海市胸科医院)



·基础研究·

β-榄香烯对人肝癌细胞HepG2增殖的影响及机制探讨

张义敏1，2，田明涛2，李萍2，唐承2

(1 山东中医药大学，济南250355；2 威海市胸科医院)

目的观察β-榄香烯对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响，并探讨其作用机制。方法取对数生长期HepG2细胞分为A、B、C、D组，分别置于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基、5 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基、10 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基、20 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基中培养。采用MTT法检测培养0、24、48、72 h时细胞增殖抑制率，采用RT-PCR法检测各组培养24 h时细胞轴蛋白(Axin)、结肠腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-连环蛋白(β-catenin) mRNA 。结果培养0、24、48、72 h各组细胞增殖抑制率均B组B组>C组>D组，各组细胞Axin、APC mRNA相对表达量为A组

肝癌；β-榄香烯；Wnt/β-catenin信号通路；轴蛋白；结肠腺瘤息肉易感基因；β-连环蛋白

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，病死率居恶性肿瘤的第3位[1]。肝癌的发生与病毒感染、肝硬化、摄入黄曲霉素、环境污染等有关，目前尚无有效治疗方法[2]。近年研究发现,多种信号转导通路与原发性肝癌的发生密切相关。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号转导通路(经典Wnt通路)在生物发育、细胞转运、凋亡等过程中发挥重要作用[3]，其异常活化与肿瘤的发生、发展关系密切[4]。轴蛋白(Axin)、结肠腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-catenin是Wnt信号通路中的重要组成因子。莪术是我国姜科植物蓬莪术或温郁金、广西莪术的根茎，具有行气破血、消积止痛的功效，以往常用于治疗癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛[5]。现代药理研究发现，莪术具有抗肿瘤作用[6]。莪术根茎提取物β-榄香烯是莪术抗肿瘤的3种有效成分之一，可抑制肿瘤细胞的增殖，但其具体作用机制目前尚不明确。2014年8月～2015年11月，我们观察了β-榄香烯对体外培养的人肝癌细胞HepG2增殖的影响，并探讨其可能机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料HepG2购自中国科学院上海生化所细胞库，RPMI 1640培养基与胎牛血清均购自Gibco公司，β-榄香烯购自中国药品生物制品检定所(NICPBP)，兔抗β-catenin、Axin、APC多克隆抗体购自Santa Cruz Biotech公司；鼠抗β-catenin、Axin、APC购自Beyotime公司。Tris、DTT、SDS、Nuclease Mix等购自美国Sigma公司，Immobiline Drystrip Cover Fluid、Immobiline Drystrip PH3-10NL等购自美国GE公司，Temed、CHAPS、 Electrophoresis Regent(T9281)购自美国Simga公司，CCK-8试剂盒购自江苏碧云天公司。

1.2细胞分组及干预取对数生长期HepG2细胞，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640体外培养基，37 ℃、5%CO2、饱和湿度无菌培养箱中培养。将细胞分为A、B、C、D组，分别置于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基、5 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基、10 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基、20 μg/mL β-榄香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培养基中培养。

1.3HepG2细胞增殖观察采用MTT 法。取各组对数生长期细胞接种于96孔板，3×103/孔，每组6个复孔。分别于培养0、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8，2 h后用酶标仪检测波长450 nm处光密度(OD)值。以A组为对照，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(OD对照-OD观察)/OD对照×100%。实验共重复3次。

1.4HepG2细胞β-catenin、Axin、APC mRNA检测采用RT-PCR法。取各组培养24 h时对数生长期细胞，TRIzol法提取总RNA，反转录合成cDNA，采用sybr染色相对定量目标基因的表达，具体实验步骤与条件参考文献进行[7]，引物购自克劳宁生物科技有限公司，以β-actin为内参。β-catenin上游引物5′-ATGACTCGAGCTCAGAGGGT-3′，下游引物5′- ATTGCACGTGTGGCAAGTTC -3′；Axin上游引物5′-ACCGAAAGTACATTCTTGATAAC-3′，下游引物5′-TCCATACCTGAACTCTCTGC-3′；APC上游引物5′-GGATGGAGAAGGCGAAAGTGAG-3′，下游引物5′-TTGCCAAAGGGTAGGGAAATG-3′。以反转录获得的cDNA为模板，分别扩增Axin、APC和β-catenin，复性温度分别为52 ℃、52 ℃、55 ℃，循环数均为30次。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(100 V、30 min)后，用BioImaging system观察成像。用NIH image software分析产物带灰度，以产物带与β-actin条带的灰度比值表示该基因的相对表达量，实验重复3次。

2　结果

2.1各组细胞增殖抑制率比较见表1。

表1　各组细胞增殖抑制率比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，#P<0.05；与同组前一时点比较，☆P<0.05。

2.2各组细胞β-catenin、Axin、APC mRNA表达比较见表2。

表2　培养24 h时各组细胞β-catenin、Axin、APC mRNA相对表达量比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

3　讨论

中药单体或复方抗肿瘤的确切疗效已得到国际公认，是近年来研究热点。中药可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，具有多靶点、多环节、多效应的特点。其在抑制、杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征，以及减轻放化疗不良反应、延长患者生存期等方面发挥重要作用；同时，具有不良反应少，能提高机体免疫力，不易产生耐药性等特点。β-榄香烯是莪术主要成分之一，是临床用于治疗恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的潜在新药，具有很强杀灭肿瘤细胞及抑制肿瘤生长作用[8]。研究发现，榄香烯联合TACE治疗肝癌可增加肿瘤反应率，延长肿瘤进展时间，并能够有效改善肝癌患者的生存质量[9，10]，但其具体机制尚有待探讨。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生、发展及预后中起着重要的作用，针对Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子靶向治疗肝癌，已成为肝癌治疗的新方向[11]。β-catenin/T细胞可调节Wnt靶基因的表达，其中β-catenin是正向调节因子，APC、Axin在Wnt信号转导通路中起负向调节作用[12，13]。研究认为，β-catenin基因是一种原癌基因，其表达产物β-catenin主要位于细胞膜，是Wnt信号通路的关键调节因子，决定着Wnt信号的开放或关闭。正常情况下，β-catenin介导Wnt信号从细胞膜到细胞质及细胞核的传递，从而使Wnt信号转导通路得以启动激活并顺利进行[14]。在异常Wnt信号通路中，β-catenin降解障碍致使细胞质内游离的β-catenin积聚并进入细胞核，并最终导致癌变的发生[15]。APC蛋白是一个多功能蛋白，可作为一个多种蛋白质复合物相互连接的骨架，在细胞周期、运动、黏附以及信号传导过程中发挥着重要作用，是Wnt信号转导通路的重要组成分子[16]。APC蛋白可控制β-catenin在细胞内的含量,在正常细胞内通过与Axin、GSK-3β蛋白结合，促进β-catenin在细胞内的降解[17]。APC基因突变或蛋白异常可使Wnt信号转导通路异常激活，引起多种原癌基因持续转录而最终导致肿瘤的发生[18]。Axin与APC一样，是一种重要的骨架蛋白，是支架蛋白复合体的构建基础，同时通过Wnt信号转导途径参与一系列生物学效应的调控,如体轴发育、细胞死亡、神经元的分化等，是一个新发现的肿瘤抑制因子[19]。Axin在各种肿瘤组织中存在不同情况的突变，其无法发挥在Wnt信号传导通路的调节作用，使细胞正常凋亡无法继续进行，引起肿瘤细胞异常增殖。

本研究发现，培养0、24、48、72 h,各组细胞增殖抑制率均为B组B组>C组>D组，β-catenin、Axin、APC mRNA相对表达量为A组

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唐承(E-mail: tangcheng968@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.009

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A

1002-266X(2016)18-0029-03

2016-03-18)