乙酰化对二甲基精氨酸二甲胺水解酶1表达水平的影响

王　曦,李英慧,陈芳杰

(1.武警辽宁省总队医院军人病区,沈阳110034;2.中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室,沈阳110122)

乙酰化对二甲基精氨酸二甲胺水解酶1表达水平的影响

王曦1,李英慧2,陈芳杰2

(1.武警辽宁省总队医院军人病区,沈阳110034;2.中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室,沈阳110122)

目的以去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaBu)和乙酰转移酶p300作为乙酰化作用因素,探讨人胚肾HEK293细胞中乙酰化对二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)表达水平的调节.方法应用rea1-time PCR方法检测NaBu刺激或转染野生型及突变型p300表达载体后DDAH1mRNA表达水平的变化;应用Western b1ot方法检测NaBu和p300对DDAH1蛋白表达水平的影响.结果Rea1-time PCR结果显示NaBu以时间依赖方式上调DDAH1mRNA表达水平,同时转染野生型p300表达载体显著上调DDAH1mRNA水平,而突变型p300作用不明显;Western b1ot结果显示NaBu及野生型p300可提高DDAH1蛋白表达,但突变型p300无此作用,与对DDAH1mRNA表达的作用一致.结论乙酰化可上调HEK293细胞中DDAH1mRNA和蛋白表达水平.

二甲基精氨酸二甲胺水解酶1;丁酸钠;p300;乙酰化

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一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种与血压水平密切相关的有生物活性的小分子物质,它在体内由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化合成.NOS包括神经型(neurona1 NOS,nNOS)、诱导型(inducib1e NOS,iNOS)和内皮型(endothe1ia1 NOS, eNOS)3种.非对称性二甲基精氨酸(asymmetrica1 dimethy1arginine,ADMA)是体内3种NOS的抑制剂,它能够抑制NOS活性,降低NO生物效应.ADMA由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethy1arginine dimethy1aminohydro1ase,DDAH)降解[1～3],后者包括DDAH 1和DDAH 2两种亚型.DDAH 1是肾脏近曲小管和肝脏中的主要亚型,其表达水平上调可提高NO生物效应,降低血压.乙酰化是调节基因表达水平的一种重要表观遗传学机制.本研究以去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaBu)和乙酰转移酶p300作为乙酰化作用因素,探讨乙酰化对人胚肾HEK293细胞中DDAH1表达水平的影响,从而寻找DDAH1基因的一种表达调控机制.

1　材料与方法

1.1细胞培养

人胚肾HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养.1 mmo1/L NaBu刺激细胞,分别于0、6、12、24、48 h后收获细胞.应用Lipofectamine 2000(美国In-vitrogene公司)转染野生型或组蛋白乙酰转移酶(histone acety1transferase,HAT)结构域缺失的突变型p300表达载体,转染后24 h收获细胞.

1.2RNA提取及rea1-time PCR

应用TRIzo1试剂常规方法提取收获细胞的总RNA,采用反转录试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA.应用SYBR Green染料法进行rea1-time PCR扩增,引物序列如下:DDAH1特异性引物,上游,5′-GGCAGATGGGTTGCATTTGA-3′,下游,5′-TGTCAT CAGGCACAGTGAGT-3′;同时β-actin作为内参,其引物序列如下:上游,5′-AGCAGATGTGGATCAGCA AG-3′,5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3′.PCR在优化的反应条件下进行,采用相对定量方法,每个样品扩增3次,取平均值作为样品的相对表达量.

1.3蛋白提取及Western b1ot

使用单去污裂解液提取细胞总蛋白.煮沸后上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,低温电转至PVDF膜,封闭.分别以1∶500和1∶1 000稀释的DDAH1或β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)为一抗进行杂交2 h,洗膜后加入1∶3 000稀释的二抗杂交2 h.化学发光法检测杂交信号.以DDAH1灰度值与β-actin灰度值的比值作为DDAH1蛋白相对表达量.

1.4统计学处理

每个实验至少重复3次,应用SPSS 13.0进行数据统计分析.组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义.

2　结果

2.1乙酰化对DDAH1mRNA表达水平的调节

2.1.1NaBu刺激对DDAH1mRNA水平的影响:rea1 -time PCR结果显示(图1),NaBu刺激细胞不同时间后,DDAH1mRNA表达水平以时间依赖方式上升, 24 h后表达水平达峰值,因此后面的实验中选择刺激24 h的时间点.

2.1.2p300对DDAH1 mRNA水平的影响:应用野生型p300表达载体转染细胞后,DDAH1 mRNA表达水平显著上升(P<0.05),而HAT结构域缺失的突变型p300表达载体(p300 mut)作用不明显(图2, P>0.05),提示p300对DDAH1mRNA水平的影响依赖于HAT结构域.

2.2乙酰化对DDAH1蛋白表达水平的调节

2.2.1NaBu刺激对DDAH1蛋白水平的影响:Western b1ot结果显示,NaBu刺激后,DDAH1蛋白表达水平显著上升,与mRNA表达水平变化一致,见图3.

2.2.2p300对DDAH1蛋白水平的影响:结果显示,野生型p300显著上调DDAH1表达,而突变型p300无此作用,这与p300对DDAH1 mRNA水平的作用一致,见图4.

图1　NaBu刺激不同时间后DDAH1m RNA表达水平的变化Fig.1 Changes of DDAH1 mRNA level afte r NaBu trea tm ent of different time periods

图2　p300对DDAH1 m RNA表达水平的影响Fig.2 Effect o f p300 on DDAH1 m RNA exp ression

3　讨论

多种蛋白质(包括组蛋白和许多转录因子)的乙酰化参与调控基因表达水平,蛋白的乙酰化水平主要受2类酶的调节,包括HAT和组蛋白去乙酰化酶(histone deacety1ase,HDAC).NaBu是一种HDAC抑制剂,它可以抑制多种HDAC的作用,从而上调蛋白乙酰化水平;p300是一种最为经典的HAT,它可以调节组蛋白及多种转录因子的乙酰化,从而参与很多基因的表达调控.p300是一种具有多个结构域的大分子蛋白质,其中HAT结构域对其乙酰化功能至关重要[4,5].本研究选择了NaBu刺激细胞、转染野生型、HAT结构域缺失的突变型p300表达载体作为乙酰化作用因素来处理细胞.

在体内ADMA的蓄积可导致血管内皮功能障碍、阻力增加,其水平在高血压患者体内中明显升高.研究表明ADMA的蓄积主要由于DDAH作用减弱引起,许多高血压危险因素通过降低DDAH活性影响NOS和NO作用,从而参与高血压的发生发展[6～8].有研究[9]发现DDAH1转基因小鼠血浆ADMA水平显著下降,NOS和NO生物效应明显提高,并可使小鼠收缩压下降13 mmHg.因此DDAH1基因表达水平的调节对血压水平至关重要.

图3　NaBu对DDAH1蛋白表达水平的影响Fig.3 Effect of NaBu on DDAH1 p rotein level

图4　p300对DDAH1蛋白水平的影响Fig.4 Effect of p300 on DDAH1 protein expression

为探讨乙酰化是否参与DDAH1基因表达的调节,本研究一方面选择了NaBu来抑制HDAC作用,另一方面通过外源转染p300表达载体增加HAT作用.结果显示,NaBu以时间依赖方式上调DDAH1 mRNA表达水平,提示乙酰化参与调节DDAH1表达.同时,研究结果显示NaBu的作用于24 h达到峰值,48 h开始下降,这可能是由于NaBu长时间作用于细胞后某些负反馈抑制作用的结果.同时转染野生型p300表达载体可显著上调DDAH1mRNA表达,而HAT结构域缺失的突变型p300无此作用,说明p300对DDAH1的调节依赖于HAT结构域,进一步证明了乙酰化对DDAH1表达的作用.Western b1ot的结果也证明NaBu和p300对DDAH1蛋白表达的作用,与它们对DDAH1mRNA水平的作用一致.

综上所述,本研究证明了乙酰化这一表观遗传学机制对DDAH1表达的调节作用,这一机制有可能通过影响NO水平而在血压调节中发挥一定的作用.当然,本研究仅鉴定了乙酰化对DDAH1表达水平的影响,尚未阐明乙酰化调节其表达的具体机制,这将有待进一步鉴定.

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(编辑武玉欣)

EffectofAcetylation on theExpression of DimethylarginineDimethylam inohydrolase1

WANGXi1,LIYing-hui2,CHENFang-jie2
(1.Mi1itaryWard,LiaoningProvincia1CorpsHospita1ofPAPF,Shenyang110034,China;2.DepartmentofMedica1Genetics,Co11egeofBasicMedica1Science,China Medica1University,Shenyang110122,China)

Objective Toassess theeffectofacety1ation on theexpression ofdimethy1argininedimethy1aminohydro1ase1(DDAH1)in human embryonic kidney(HEK)293 ce11s by using deacety1ase inhibitor sodium butyrate(NaBu)and acety1transferase p300 as the inducers of acety1ation. M ethods Rea1-time PCR was adopted to detect the changes of DDAH 1mRNA 1eve1 after the treatment of NaBu or with the transfection of wi1dtype or mutated p300 p1asmid.Western b1ot was carried out to assess the effect of NaBu or p300 on DDAH1 protein 1eve1.Results Resu1ts of rea1-time PCR showed that NaBu may up-regu1ate DDAH1mRNA 1eve1 in a time-dependent manner.Wi1d-type p300 significant1y increased the DDAH 1 mRNA expression,but mutant p300 showed 1ess effect.Western b1ot resu1ts demonstrated that NaBu and wi1d-type p300 may enhance DDAH1 protein expression,and no effect was observed with mutant p300,which was in accordance with their effects on DDAH1mRNA 1eve1. Conclusion Acety1ationmayup-regu1ate DDAH1mRNA and protein 1eve1in HEK293 ce11s.

dimethy1arginine dimethy1aminohydro1ase 1;sodium butyrate;p300;acety1ation

R394

A

0258-4646(2016)03-0230-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.010

辽宁省自然科学基金(2014021061)

王曦(1976-),男,主治医师,本科. E-mai1:frankwang_1i@126.com

2015-03-15

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