磁性纳米Fe3O4载新藤黄酸复合物的制备和表征*

戴雅吉， 王　芳， 黄　鹏

(安徽中医药大学药学院，安徽　合肥　230012)



磁性纳米Fe3O4载新藤黄酸复合物的制备和表征*

戴雅吉， 王芳， 黄鹏

(安徽中医药大学药学院，安徽合肥230012)

采用化学共沉淀法制得Fe3O4磁性纳米微粒，并用柠檬酸进行修饰，制备纳米四氧化三铁载新藤黄酸共轭复合物。利用TEM，XRD，IR对纳米四氧化三铁和柠檬酸修饰Fe3O4进行表征，磁性四氧化三铁及其修饰物磁性良好，平均粒径在15 nm左右，柠檬酸包裹后粒径变大，但并未改变四氧化三铁的晶型；并通过UV对纳米四氧化三铁载新藤黄酸复合物进行表征，结果表明磁性纳米Fe3O4载新藤黄酸复合物制备成功。

纳米磁性Fe3O4-新藤黄酸；制备；表征

藤黄是藤黄科植物藤黄(Garcinia hanbury i Hook. f.) 所分泌的干燥树脂。藤黄具有攻毒蚀疮、破血、散结等功效,中医传统用于消肿、化毒、止血等病。新藤黄酸为藤黄的有效成分之一，其抗瘤谱广，且毒性较低，对于人非小细胞肺癌细胞A549、HCT-8、HeG2等肿瘤细胞具有较好的抑制作用[1-6]。由于新藤黄酸的水溶性差、刺激性大及生物利用度较低[7]，需要进一步研究加以改善。

近年来，关于磁性纳米材料的研究报道很多。磁性纳米材料具有纳米材料所特有的性质, 其粒径小,比表面积大,偶联容量高,又具有超顺磁性,可以在磁场下聚集和定位，特别是这类材料应用领域广，可作为先进的磁性材料[8]、染料[9]和催化剂[10]等，另外在磁共振成像[11]和靶向载药[12]方面也具有广阔的应用前景。优良的药物载体应具有防止药物局部浓度过高，减少药物的损失及降解，降低其副作用，提高生物利用度，缓释、控释，靶向给药等特点[13-16]磁性纳米材料一方面具有较好的生物相容性，能吸附药物到达病灶，保证局部给药，降低了药物的副作用，提高疗效；另一方面药物载体可以进行磁靶向给药。基于磁性材料良好的生物相容性和磁靶向性，以柠檬酸修饰的Fe3O4磁性纳米粒为核，在RPMI-1640培养液中，通过其活泼羧基与新藤黄酸以共价键结合，制备出磁性纳米Fe3O4载新藤黄酸复合物，为提高新藤黄酸抗肿瘤的靶向性，降低刺激性和增加生物利用度提供新的思路和方法。

1　实验部分

1.1试剂和仪器

新藤黄酸(纯度>98%)，自制；RPMI-1640培养液、新生牛血清，Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.；六水合三氯化铁，四水合二氯化铁，氨水(25%)，柠檬酸，无水乙醇等均为分析纯。

Nicolet NEXUS-870傅立叶红外光谱仪，美国尼高力仪器公司；UV3600紫外分光光度计，日本岛津公司；JEM-2100高分辨透射电子显微镜，日本电子；XD-3X射线衍射仪，北京普析通用仪器。

1.2实验方法

1.2.1纳米四氧化三铁粒备

称取1.05 g FeCl2·4H2O和2.61 g FeCl3·6H2O，在氮气保护的条件下，100 mL蒸馏水超声溶解配置成Fe3+：Fe2+约为1.75:1的溶液，溶液混合倾入三口烧瓶中缓慢搅拌20 min，同时逐渐加温到80 ℃。缓慢滴加氨水10 mL，剧烈搅拌30 min，溶液逐渐变成黑色，停止搅拌后迅速利用磁分散技术，在外加磁场作用下将黑色Fe3O4纳米粒子水洗数次，至pH显中性，60 ℃真空干燥。

1.2.2柠檬酸修饰四氧化三铁纳米粒子

采用分散聚合法，1.25 g柠檬酸溶解到100 mL水溶液中，将1.2.1中制备的纳米Fe3O4分散到该溶液中，搅拌，升温至80 ℃，剧烈搅拌90 min，溶液由黑色逐渐变成浅灰色，停止搅拌后冷却，超声分散30 min，磁分离，蒸馏水洗至pH显中性，所得物60 ℃真空干燥，称重，得柠檬酸修饰Fe3O4。

1.2.3柠檬酸修饰纳米Fe3O4载新藤黄酸复合物的制备

将新藤黄酸于二甲基亚砜中充分溶解，取2.7 mL RPMI-1640培养液，0.3 mL新生牛血清蛋白于锥形瓶中平行配置两份，各加0.23 mg柠檬酸修饰Fe3O4，超声溶解至底部无沉淀，其中一份加新藤黄酸0.15 mg，使浓度为0.05 mg/mL，超声分散，4 °C低温培养48 h，备用。

另精密称取新藤黄酸4.00 mg溶解于18 mL RPMI-1640培养液，2 mL 新生牛血清蛋白的培养基中，配置成0.20 mg/mL新藤黄酸标准液，4 °C低温培养48 h，备用。

1.2.4纳米Fe3O4-新藤黄酸含量测定

据文献报道，新藤黄酸在300～500 nm有紫外吸收[17]。目前测定新藤黄酸含量的方法主要是HPLC，但其前处理比较繁琐，因此采用UV测定纳米磁性Fe3O4-新藤黄酸中新藤黄酸的含量。

分别取上述配置的新藤黄酸药物0.005 mL，0.50 mL，1.00 mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL，5.00 mL，6.00 mL，7.00 mL稀释到10 mL容量瓶中，配成浓度为0.001 mg/mL， 0.01 mg/mL，0.02 mg/mL，0.04 mg/mL，0.06 mg/mL，0.08 mg/mL，0.1 mg/mL，0.12 mg/mL，0.14 mg/mL的溶液，超声分散，于300 nm～700 nm波长测范围内测紫外，选择新藤黄酸的检测波长，依次在最大波长处测上述不同浓度的标准液，得图谱(见图5)。

采用低温超速离心法，将1.2.3中配置的纳米磁性Fe3O4-新藤黄酸10000 r/min离心1 h。除去游离的新藤黄酸药物，下层固体用3 mL培养液溶解，超声分散，于300 nm～700 nm波长处测柠檬酸包裹的纳米粒和载药纳米粒子的紫外吸光度(见图6)。

2　结果与讨论

2.1纳米Fe3O4和纳米Fe3O4-柠檬酸的磁性分析

由图1A、B可见磁性纳米Fe3O4和柠檬酸修饰Fe3O4纳米粒加上外加磁场后，溶液中的磁性纳米粒子吸附到磁场一端，溶液恢复澄清，证明产物有磁性。

图1　纳米四氧化三铁(A)和纳米四氧化三铁-柠檬酸(B)

2.2纳米Fe3O4和纳米Fe3O4-柠檬酸纳米粒TEM形貌分析

制备的MNP和柠檬酸修饰后的纳米粒的TEM图谱如图2(A,B)所示，图2显示在80 ℃得到的纳米粒径较窄，约为15 nm，从形貌来看呈球形，但由于纳米粒子之间存在库仑力、范德华力等相互作用的静电力，纳米粒子外观上表现出团聚现象，粒子分散性有待提高，粒子之间的团聚主要出现在样品的干燥过程之中，由于纳米粒子的小尺寸效应，粒子的表面能很大，粒子之间通过相互作用达到稳定状态，从而出现团聚现象。图2B为纳米Fe3O4-柠檬酸，在水溶液中Fe3O4纳米粒子表面包裹柠檬酸后，磁性粒子之间直接接触的机会减少，随粒子尺寸变大平均15 nm，表面能减小，改善了粒子的团聚现象，增强了纳米粒子的分散性。

图2　纳米四氧化三铁(A)和纳米Fe3O4-柠檬酸(B)的TEM照片

2.3纳米Fe3O4和修饰后Fe3O4纳米粒XRD分析

图3为纳米Fe3O4和柠檬酸修饰后Fe3O4纳米粒的XRD图谱，图3A在2θ=30.2°，35.6°，43.2°，53.7°，57.2°，62.9°出现特征的衍射峰，此峰位与Fe3O4标准卡片JCPDS 79-0417很好地吻合，只是在强度上有所不同，表明纳米结构主要是四氧化三铁，其衍射峰分别属于Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(333)，(440)得晶体形状及对应结构。图3B显示相同的衍射峰，说明柠檬酸修饰Fe3O4-MNP并没有改变纳米粒子的晶型。修饰前后的Fe3O4的XRD谱峰位相对噪音较大，可能形成的晶型不是太规则。根据图表数据由Scherrer公式β=kλ/Dcosθ，式中λ为X射线波长，k为峰形因子，D为晶体的平均粒径，θ为Bragg衍射角，β为半峰宽。由此可以计算出复合粒子的平均粒径。取衍射峰2θ=35.1°，k=0.89来计算，复合粒子的平均粒径在15 nm左右，这与透射电镜下所测得的结果基本相一致。

图3　纳米 纳米Fe3O4(A)和X纳米Fe3O4-柠檬酸(B)的XRD

2.4纳米Fe3O4和修饰后Fe3O4纳米粒IR图谱分析

图4　纳米Fe3O4-柠檬酸(A)和磁性纳米Fe3O4(B)的IR图

纳米Fe3O4和修饰后Fe3O4纳米粒IR图谱如图4，图4中由于-OH的伸缩振动在3417 cm-1附近有谱带，其弯曲振动的谱带在1618 cm-1附近，544 cm-1附近对应的是Fe-O-Fe的伸缩振动。而图5的1619 cm-1，1434 cm-1，665 cm-1，641 cm-1，632 cm-1分别对应于图4的1588cm-1，1393 cm-1，660 cm-1，645 cm-1，633 cm-1的峰，3370 cm-1，3186 cm-1峰有交叉，且峰型较宽，3370 cm-1对应的是柠檬酸的羟基氢与Fe3O4的氧原子缔合成的氢键，3186 cm-1对应于-CH2-伸缩振动，这些都说明柠檬酸以非共价健与Fe3O4牢固结合，将Fe3O4纳米粒包裹，形成表面含羟基等亲水性基团。

2.5载药纳米粒UV图谱分析

图5　不同浓度新藤黄酸UV图谱

由图5可见411 nm有最大吸收波峰，而且此处无干扰，选择411 nm作为检测波长，分别测各标准液的吸光度A值为 0.342、0.55、0.826、1.276、1.626、2.103 。以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程为: A=19.909c+0.0787, r=0. 9968，相关性良好。结果表明在10～100 μg/mL浓度范围内，新藤黄酸的浓度与峰面积呈较好的线性关系。

图6　纳米Fe3O4-柠檬酸(A)载新藤黄酸后的纳米四氧化三铁(B、C)的UV图谱

图6中A为纳米Fe3O4-柠檬酸UV图，B、C为低温离心法稀释的载新藤黄酸纳米Fe3O4-柠檬酸UV图。由图6可见A、B、C区别在于，B、C在411 nm处有吸收，而A曲线未出现，其余峰一致，说明药物通过非共价键与柠檬酸修饰的四氧化三铁结合牢固。

3　结　论

利用共沉淀法较为简单快速的合成了磁性四氧化三铁纳米粒子，平均粒径在10 nm左右，柠檬酸包裹厚度约5 nm，修饰后平均粒径为15 nm，粒子粒径和水溶性均增加，分子间引力减小，粒子分散性提高，且形貌并未改变，呈球形。通过紫外光谱法测定纳米磁性Fe3O4载新藤黄酸复合物的含量，发现新藤黄酸可以以分子间引力与磁性Fe3O4纳米粒结合，一定程度上解决新藤黄酸药物水溶性差、生物利用度低的问题，同时也为提高水不溶性抗肿瘤药物的靶向性、增强药物水溶性提供新的思路和方法。

[1]侯文洁,萧伟. 藤黄酸的研究进展[J].中草药,2011,42(3):617-621.

[2]朱国旗,程卉,王训翠,等.新藤黄酸体外抑制肺腺癌A549 细胞增殖的作用[J].安徽中医学院学报,2011,30(1):53-56.

[3]晏烽根,李庆林.新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡以及对 p-p38 和 p-ERK1/2 蛋白的影响[J].中国药理学通报,2011,27(3):355-359.

[4]杨莉,王梅,程卉,等.新藤黄酸诱导细胞凋亡抑制 A549 细胞裸鼠移植瘤增长的研究[J].中国中药杂志,2011,36(9):1217-1221.

[5]周兰贞,晏烽根,李庆林.新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究[J].肿瘤,2011,31(7):580-584.

[6]程卉,彭代银,王效山,等.新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究[J].中草药,2008,39(2):236-240.

[7]陈延杰,陈卫东,雷妮，等.新藤黄酸固体脂质纳米粒在大鼠血浆中的稳定性考察[J].安徽医药,2011,15(6):679-680.

[8]T. J. Daou,G. Pourroy,S. Bégin-Colin,et al.Hydrothermal Synthesis of Monodisperse Magnetite Nanoparticles[J].Chem. Mater,2006,18:4399-4404.

[9]T. P. J. Knowles, M. J. Buehler.Nanomechanics of functional and pathologica amyloid materials[J]. Nature Nanotechnology,2011(6):469-478.

[10]Nhiem Trana, Thomas J. Webster.Magnetic nanoparticles: biomedical applications and challenges[J]. Journal of Materials Chemistry,2010,20:8760-8767.

[11]A Lascialfari,C Sangregorio.Magnetic Nanoparticles in biomedicine[J]. Chimica oggi/Chemistry Today,2011,29:20-23.

[12]S.S. Banerjee, D.H Chen.Magnetic Nanoparticles Grafted with Cyclodextrin for Hydrophobic Drug Delivery[J].Chem.Mater,2007,19:6345-6349.

[13]柴波.微乳液法制备四氧化三铁磁性纳米粒子的研究[J].武汉工业学院学报,2006,25(1):65-67.

[14]张伟等.化学共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒的研究进展[J].内蒙古科技大学学报，2012,31(4):2-3.

[15]封余贤,乔磊磊,蓝平,等.磁性纳米四氧化三铁制备研究进展[J].化学世界,2013(1):50-54.

[16] F.Y Chenga, C.H Sua,Y.S Yang,et al.Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4nanopartic[J].Nature Nanotechnology,2011(6):469-478.

[17]胡海霞,王效山.高效液相色谱法测定新藤黄酸羟丙基-β-环糊精包合物冻干粉中新藤黄酸含量[J].安徽中医学院学报,2011,30(3):55-57.

Preparation and Characterization of Magnetic Nano Fe3O4Load Neogambogic Acid*

DAIYa-ji,WANGFang,HUANGPeng

(College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230012, China)

Fe3O4magnetic nanoparticles were prepared by chemical coprecipitation method, and nanoparticles were modified Neo-gambogic acid to prepare ferroferric oxide nano-neo gambogic acid conjugate complex. Fe3O4and citric acid modified Fe3O4were characterized by TEM, XRD and IR. Magnetic ferroferric oxide and its modification of magnetic were good, with an average size of about 15 nm, the size of the citric acid was increased after the inclusion of the citric acid, but did not change the crystal type of magnetite. The Fe3O4nanoparticles loading of neogambogic acid complexes were characterized by UV. The results showed that preparing the magnetic nanoparticles of Fe3O4loaded neo gambogic acid compound was successful.

neo-gambogic acid-loaded magnetic Fe3O4nanoparticles; preparation; characterization

安徽省教育厅自然科学研究项目(项目编号：KJ2014A134)。

戴雅吉(1992-)，女，硕士研究生。

黄鹏(1977-)，男，副教授，主要从事药学的教学与科研工作。

Q946

A

1001-9677(2016)02-0071-04