中药藤黄研究进展

2014-03-27王园园汪盈盈

长江大学学报(自科版) 2014年23期

关键词：藤黄细胞株细胞

王园园，汪盈盈

（亳州职业技术学院药学院，安徽亳州236800；安徽省亳州市中药研究所，安徽亳州236800）

曹银

（合肥市第四人民医院药剂科，安徽合肥230000）

丁瑞苹，訾少峰

（亳州职业技术学院药学院，安徽亳州236800；安徽省亳州市中药研究所，安徽亳州236800）

藤黄为藤黄科植物藤黄树（Garcinia hanbar yi Hook.f.）的树干被割后分泌的胶状树脂［1］，为管状或不规则块状物，直径3～5c m，显红黄色或橙黄色，外被黄绿色粉霜，有纵条纹。质硬脆，断面平滑，呈贝壳状，具黄褐色而带蜡样光泽。气微，味辛辣，以红黄色断面似蜡质半透明、无杂质者为佳［2－3］。始载于《海药本草》（李珣.海药本草.皖南医学院科研科印，1983：26.），酸涩有毒，列于木部，李时珍移入《本草纲目》草部［4］。藤黄性寒，味酸、辛、涩，有毒，具有破血散结、解毒等作用，自古以来就用来治疗瘰疬、痈疸、疖肿等顽疾［5］。多项研究表明中药藤黄具有抗肿瘤功能，临床上用于治疗乳腺癌、淋巴肉瘤、皮肤癌均获得一定效果，并证明藤黄中抗肿瘤主要起效成分为藤黄酸、新藤黄酸和别藤黄酸等［6－10］。

1 藤黄的化学成分

藤黄为混合物，包括树胶和树脂等，其中树胶约占15%～25%，树脂约占70%～80%。酸性成分是藤黄树脂的主要活性成分，分别为藤黄酸（Gambagic acid）、新藤黄酸（Neo－ga mbogic acid）和别藤黄酸（Alloga mbogic acid）等［11］。陈葆仁［10］通过紫外、核磁共振等方法确认了藤黄酸和新藤黄酸为藤黄的主要化学成分；1984年吕归宝等［11］从中又分离得到另一种新的酸性成分，命名为新藤黄酸；1988年吕归宝等［12］采用HPLC法对购自江西等地的藤黄进行了藤黄酸和新藤黄酸含量测定，作为藤黄质量控制的依据之一。2008年杨虹等［13］将药用藤黄粉末用3～6倍95%的乙醇冷浸，提取液浓缩成浸膏，再与吡啶成盐，滤去沉淀，滤液减压浓缩后经硅胶柱多次色谱分离，以石油醚－乙酸乙酯（10∶1～1∶1）石油醚－丙酮（9∶1～1∶1）梯度洗脱，分离得到9种化合物，分别为prenyl moreollic acid、ga mbogic acid、neo－gambogic acid、morellin di methyl acetal、gambogin、hanburi、α－amyrin、3－epibetulinic acid和豆甾醇。其中prenyl moreollic acid为1个新的Xanthones类的化合物，α－amyrin、3－epibetulinic acid和豆甾醇为首次从藤黄中分离得到。贾明美等［14］利用柱层析及制备型HPLC等方法对藤黄的化学成分进行了系统研究，从中分离得到15种化合物，化合物结构用现代波谱法分别鉴定为：2α－羟基－3β－乙酰氧基白桦酯酸、10α－羟基表藤黄酸、藤黄酸、异藤黄酸、gambogin、ga mbogellic acid、isogambogenin、gambogenic acid、desoxyga mbogenin、gambogoic acid B、desoxy morellin、iso morellin、iso morellic acid、morellic acid和30－hydr oxyga mbogic acid，其中化合物2α－羟基－3β－乙酰氧基白桦酯酸和10α－羟基表藤黄酸为新发现化合物。

2 藤黄及其主要成分的抗肿瘤作用

2.1 藤黄的抗肿瘤作用

雷秋模等［15］通过试验发现藤黄对S37、S180、ARA4、W256、肝癌腹水型6种动物瘤株有明显的抑制作用，抑制率为35.16%～80.10%。刘若庸等［16］通过试验发现，藤黄与放疗合并应用能起到增强疗效，能提高小鼠肿瘤MA737放射治疗效果。程廷楷等［17］通过试验发现藤黄酸能使小鼠网织细胞肉瘤ARA4腹水细胞无丝分裂和有丝分裂指数明显降低。

2.2 藤黄总酸的抗肿瘤作用

郭青龙等［18］研究发现藤黄总酸对人的肝癌、胃癌、肺腺癌、乳腺癌细胞株的体外生长有明显的抑制作用。

2.3 藤黄酸的抗肿瘤作用

丘相寰等［19］采用流式细胞光度术（FCM）研究了藤黄酸（Gambogc Acid）对Hela细胞生长抑制的作用机制，结果表明藤黄酸对Hela细胞生长有较强抑制作用；15 mg／kg的剂量对小鼠腹水型肝癌具有同样的抑制作用。郭青龙等［20］通过试验发现藤黄酸对人肝癌细胞株QGY－7701和SMMC－7721的增殖有显著抑制作用并且抑制作用和剂量呈正相关；但是对正常人肝组织细胞株L－02作用较弱。冯素梅等［21］比较了5μg／ml的藤黄酸作用8、24h和48、20μg／ml的藤黄酸作用8、48h对肝癌细胞的损害情况，结果表明藤黄酸对肝癌细胞株具有有效的杀伤作用，其抗癌效果和药物的浓度以及药物作用的时间成正比。刘静冰等［22］采用MTT比色法、形态学观察和流式细胞术（FCM）分析研究了藤黄酸对于胰腺癌细胞株PC－3的作用，结果表明藤黄酸具有抑制胰腺癌细胞株PC－3的作用，且抑制作用与藤黄酸作用的时间有一定的依赖关系。Han等［23］也发现藤黄酸对K562细胞和阿霉素抵抗的K562细胞表现出很强的细胞毒性。黄恺飞等［24］应用MTT、Hoechst染色法证实了藤黄酸对胃癌BGC－803细胞有显著的生长抑制作用，而且还有较强的促进肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞转移的作用。许晓源等［25］利用四甲基偶氮唑蓝法检查了藤黄酸对人的恶性黑素瘤A375细胞增殖能力及细胞生长的影响，发现藤黄酸不仅能抑制A375细胞增殖还能诱导它凋亡。曲宝玺等［26］以0.5～1.5 mg／kg剂量的藤黄酸对L1210小鼠连续腹腔给药7d，结果表明藤黄酸对小鼠白血病L1210有较强的抑制能力，L1210小鼠的最大生命延长率为69.9%～119%。Bat ova等［27］报道，藤黄酸能作用于耐阿霉素的HL60／ADR细胞系，且这种作用不受耐药机制影响。舒文秀等［28］观察了藤黄酸对白血病细胞株U937增殖和凋亡的影响以及对核孔蛋白Nup88调控的作用，试验得出藤黄酸不仅能明显抑制U937白血病细胞的增殖还能诱导细胞凋亡。Wu等［29］和Zhang等［30］通过试验也证实藤黄酸对人的肺癌SPC－A1细胞株、结肠癌细胞株DLD－1及乳腺癌T47D细胞具有抑制作用。最近的研究［31］表明藤黄酸对胰腺肿瘤细胞也有一定程度的抑制和诱导凋亡的作用。

2.4 新藤黄酸的抗肿瘤作用

新藤黄酸是中药藤黄有效成分之一，研究表明新藤黄酸有很多优点，如抗癌谱广和毒性较低等［32］。曲宝玺等［33］通过药理试验证实了新藤黄酸对S180、Lewis肺癌、Las795肺腺癌等实体癌都具有较好抑制作用，而且还有选择性抗转移作用。另外，曲宝玺等［26］通过对比试验，发现新藤黄酸对小鼠白血病L1210的抑制作用优于藤黄酸，新藤黄酸给药的白血病L1210小鼠最高生存延长期可达292%而藤黄酸最高只达到119%。周兰贞等［34］通过四甲基偶氮唑蓝法检测新藤黄酸对人结肠癌的HCT116细胞的增殖是否有抑制作用时，发现G0／G1期的HCT116细胞比例显著升高，细胞周期阻滞于G0／G1期。朱国旗等［35］通过试验确定新藤黄酸有体外抑制肺腺癌细胞株A549增殖的作用，在0～4μmol／L的浓度范围内新藤黄酸可能是通过诱导细胞凋亡而发挥抑制A549细胞增殖的作用。

3 藤黄主要成分的提取分离

3.1 藤黄酸的提取

刘举等［36］对中药藤黄中的藤黄酸的提取分离方法进行了改进，他们将1000g藤黄粉末和1500g硅藻土混合通过渗漉、吡啶成盐、三次重结晶、置换萃取等步骤得到橙黄色藤黄酸单体，藤黄酸得率为23.9%，并通过红外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、电喷质谱鉴定了藤黄酸结构。

3.2 新藤黄酸的提取分离

在藤黄中新藤黄酸的含量可能达到8.01%～37.8%［37］。大量的试验表明新藤黄酸对癌症有确切的疗效，所以研究新藤黄酸的提取分离具有非常重要的意义。

刘修树等［38］在预试验的基础上确定采用回流提取法，以甲醇为提取溶剂，以新藤黄酸含量为考察指标，以甲醇浓度、甲醇量、提取时间、提取次数为考察因素，采用正交试验法L9（34）优选提取工艺，结果发现溶剂浓度对提取效果有显著影响，最终确定最优提取工艺为：以12倍量的99.5%甲醇回流提取3次，每次3h。

王可等［39］以新藤黄酸为考察指标，以HPLC法测定新藤黄酸的含量，根据单因素考察筛选试验的结果，确定以提取次数、浸提p H、浸泡时间为考察因素，对提取工艺进行优化筛选。采用L9（34）正交试验法，确定最佳提取工艺为：以12倍量的p H为7的甲醇常温浸提20 min，回流提取2次，每次5h。通过对试验结果分析得出，提取次数对提取效果影响最显著。

刘卫海等［40］用干层析柱法分离中药藤黄中的新藤黄酸，以薄层硅胶G为固定相，以三氯甲烷－甲醇－二乙胺（10∶1∶1）为流动相进行洗脱，快速有效地分离得到黄色结晶，通过IR、UV、1HNMR、MS和13CNMR方法确定所分离得到的黄色结晶化合物为新藤黄酸。

4 藤黄的主要成分制剂

4.1 藤黄酸制剂

胡海霞等［41］将藤黄酸与L－精氨酸成盐后用HP－β－CD包合，将反应液冷冻干燥。采用正交设计安排试验，通过预试验对影响包合工艺的主要因素（质量配料比、包合温度、包合时间）分别在试验范围内进行考察，以包合率（0 min释放百分比即包合率）和90 min内包合物在250 ml生理盐水中释放情况作为评价依据，优化的工艺参数为：配料比为50∶3、包合温度为50℃、包合时间8h。

李树珍等［42］用聚乳酸为载体材料，以改良的溶剂蒸发法将藤黄酸制备成藤黄酸聚乳酸纳米粒。制备的（GA－PLA－NPs）平均包封率为98.87%，载药量为13.3%，急性毒性试验测得藤黄酸纳米粒的LD50为26.3 mg／kg。说明制备的藤黄酸聚乳酸纳米粒（GA－PLA－NPs）的质量较稳定，具有良好分散性；聚乳酸将可能成为藤黄酸的新型载体。

4.2 新藤黄酸制剂

见玉娟等［43］将难溶性的新藤黄酸通过冷冻干燥法制备成新藤黄酸－羟丙基－β－环糊精包合物，有效地增加了新藤黄酸的的溶解度。

陈延杰等［44］将新藤黄酸制备成固体脂质纳米粒，在单因素考察试验结果的基础上，确定以单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆用量、乳化时间、单硬脂酸甘油酯与卵磷脂比为考察因素，以包封率为考察指标，采用L9（34）正交设计试验优选的最佳处方和工艺参数为：单硬脂酸甘油酯15 mg，泊洛沙姆浓度为0.8%、搅拌时间1h，卵磷脂30 mg。

方玲等［45］将新藤黄酸制备成脂质体冻干粉，在单因素试验考察结果的基础上，以大豆磷脂与胆固醇的质量比（A，W／W）、脂质与药物的质量比（B，W／W）、PBS溶液的p H、超声时间为因素，采用L9（34）设计正交试验，以包封率为考察指标优选最佳处方及工艺参数为：磷脂与胆固醇质量比为6∶1，磷脂与药物的比为15∶1，PBS的p H为7.4，超声时间为20 min。按最佳优选工艺制备的脂质体的包封率达到83.74%，通过电镜观察脂质体的形态圆整，其平均粒径128.30n m。

周晶等［46］采用正交试验设计法，以对新藤黄酸亲水凝胶骨架片药物的释放有较大影响的压片压力、乙基纤维素用量、羟丙甲基纤维素用量和乳糖的用量为考察因素。按L9（34）进行正交试验，通过对3个取样点（2、6、12h）释放度的分析，优选最佳处方为：30 mg新藤黄酸、90 mg HPMCK15 M、18 mg EC和45 mg乳糖，采用淀粉调节片重为300 mg，硬脂酸镁用量为片重的1%。按优选后的工艺制备3批样品在第2、6、12h时累积释放率分别为29.9%、67.7%和92.8%。

4.3 藤黄总酸制剂

侯文洁等［47］应用单因素考察法，考察指标为藤黄酸的释放度，分别考察了黏合剂的类型、填充剂的用量、制备的方法、压片机的转速以及压片时的压力对药物体外释放度的影响，通过以上试验最终确定了影响较显著的预胶化淀粉用量、HPMCK15 M用量和压片时压力作为正交试验的考察因素。采用L9（34）进行正交试验，优选处方制备工艺条件为：HPMCK15 M用量为片质量的25%、预胶化淀粉用量为15%、压片压力5.0kg／cm2。按最优工艺制备的总藤黄酸亲水凝胶骨架片2h释放约35%，6h释放约65%，10h释放约85%，12h释放约95%，满足缓释片释放要求。通过此方法制备的总藤黄酸缓释片不仅具有良好的外观和可压性，而且还有较好的释放性。

5 结语

目前关于中药藤黄的研究主要集中在有效成分藤黄酸和新藤黄酸，藤黄及其主要成分的抗肿瘤机制还没有系统阐明，关于提取和制剂方面的研究还停留在试验阶段，不能达到工业化大生产的要求，因此要将藤黄及其主要成分应用于临床必须对它们的作用机制深入研究，开发出适合于工业化生产的提取分离及制剂技术。

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