水飞蓟宾·熊去氧胆酸蒸发共沉淀物对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用*

陈　欢， 林　芳， 杨振华， 徐文微， 王　东， 刘东春△， 唐　星

(1. 沈阳药科大学中药学院， 2. 生命科学与生物制药学院， 3. 药学院， 辽宁 沈阳 110016)



水飞蓟宾·熊去氧胆酸蒸发共沉淀物对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用*

陈欢1， 林芳2， 杨振华1， 徐文微1， 王东1， 刘东春1△， 唐星3

(1. 沈阳药科大学中药学院， 2. 生命科学与生物制药学院， 3. 药学院， 辽宁 沈阳 110016)

目的：研究水飞蓟宾·熊去氧胆酸蒸发共沉淀物(SUE)对小鼠CCl4致急性肝损伤的保护作用。方法：健康昆明种雄性小鼠80只，随机分为8组(n=10)：空白组及模型组分别经口投予羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，其余60只采用CCl4腹腔注射建立小鼠急性肝损伤模型，分别给予水飞蓟宾(SLB，20 mg/kg)、熊去氧胆酸(UDCA，16.25 mg/kg)、SLB与UDCA等摩尔物理混合物(PM，36.25 mg/kg)和高中低剂量SUE(以SLB计10、20、40 mg/kg)治疗，采用单因素方差分析肝体比变化，多功能酶标仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。结果：与空白组相比，模型组肝体比有显著性升高(P<0.05)，血清中AST和ALT水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比SLB、PM、SUE组血清AST、ALT显示有不同程度的下降(P<0.05)，但UDCA组无显著性差异；与SLB和PM相比，SUE能明显降低小鼠血清ALT、AST含量(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖关系。结论：SUE对CCl4所致小鼠急性肝损伤有较好的保护作用，说明LB与UDCA制备成共沉淀物后，可更好的发挥协同作用，提高联合应用的药效。

水飞蓟宾；熊去氧胆酸；共沉淀物；四氯化碳；保肝；小鼠

水飞蓟宾(silybin，SLB)是从菊科植物水飞蓟(SilybummarianumL. Gaertn)的种子中提取分离得到的一对儿黄酮木脂素类化合物，被广泛应用于治疗肝炎、肝硬化和毒性肝损伤等疾病，其保肝机制为抗氧化、抗脂质过氧化、抗纤维化、细胞膜稳定作用和调节肝细胞再生能力等[1-3]。但是SLB为一种难溶性的细小晶体，生物利用度不高，影响其药效的发挥。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是中药熊胆的有效成分，是一种非细胞毒性的胆汁酸，临床主要用于治疗慢性肝炎和原发性胆汁淤积性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等各种胆汁淤积性肝病[4,5]。有临床试验表明，SLB和UDCA联合应用治疗非酒精性脂肪肝较单用SLB有较好疗效[6]，将SLB和UDCA制备成蒸发共沉淀物(silybin-ursodeoxycholic acid evaporated coprecipitate，SUE)，可以提高SLB的体外溶出及生物利用度[7]。为了进一步验证SUE的肝脏保护作用，本研究采用CCl4制造小鼠急性肝损伤模型，观察SUE对实验性肝损伤的保护作用。

1　材料与方法

1.1实验仪器与试剂

Synergy HT 型多功能酶标仪(BioTek基因有限公司)，J2-HS型低温离心机(Beckman公司)，JJ500型电子天平(常熟市双节测试仪器厂)。SLB原料药(辽宁盘锦华成制药有限公司，批号20130301)，UDCA原料药(武汉远成共创科技有限公司，批号20100510)，SLB与UDCA等摩尔物理混合物(Physical Mixture, PM)，SUE(自制，批号20140311)，CCl4(分析纯，批号20140223，天津博迪化工有限公司)，门冬氨酸转移酶(AST)试剂盒、丙氨酸转移酶(ALT)(批号20141212、20141215，南京建成生物工程研究所)。

1.2实验方法及动物分组

SUE的制备[7]：将等摩尔的SLB与UDCA完全溶解于适量的无水乙醇，然后采用旋转蒸发仪回收溶剂至干，必要时进一步减压干燥至无醇味，粉碎过80目筛即得。

取健康昆明种雄性小鼠80只，由沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：211002300004781。随机分为8组(n=10)，给药组分别灌胃给药SLB(20 mg/kg)，UDCA(16.25 mg/kg)，PM(以SLB计为20 mg/kg)，SUE(以SLB计为10、20、40 mg/kg，SUE-10，SUE-20，SUE-40)，灌胃药物用0.3%(w/w)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬均匀，配制相应浓度，按20 mg/kg药液体积灌胃，空白组和模型组均灌胃给予相应体积的0.3%的CMC-Na水溶液，每日1次，连续2 d，第2次给药(即实验开始后24 h)0.5 h后，除空白组外，其他各组分别腹腔注射0.2% CCl4大豆油溶液，空白组腹腔注射大豆油，注射体积为10 ml/kg，5 h后第三次给药，同时禁食不禁水。末次给药11 h后各组小鼠称重，摘眼球取血，分离血清冰盒保存待测；并解剖小鼠，分离完整肝脏，生理盐水洗净，滤纸吸干后称量肝脏重量并记录。

1.3小鼠体重变化和肝体比计算

将小鼠实验期间体重变化作图，比较各组小鼠体重变化差异； 根据末次体重和小鼠肝脏重量计算肝体比(肝脏重量/体重)。

1.4AST和ALT指标检测

血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)含量的测定按照试剂盒说明书操作，采用多功能酶标仪检测。

1.5统计学处理

2　结果

2.1对小鼠体重和肝体比的影响

各组小鼠在实验期间体重未见明显差异。与空白组相比，模型组动物肝体比显著升高(P<0.05)，提示肝脏因为CCl4毒性导致急性炎症性肿大；与模型组相比，其余各组肝体比无显著性变化(图1)。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio; SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate

*P<0.05vscontrol group

2.2对小鼠血清中AST及ALT的影响

与control组相比，model组中血清AST与ALT水平均显著升高(P<0.01)。与model组相比，UDCA组AST与ALT都没有显著性变化，SLB组和PM组仅AST水平显著性降低(P<0.05)，ALT水平没有显著性变化；SUE各剂量组AST和ALT水平有显著性降低(P<0.05，P<0.01)，且呈剂量依赖性，其中以高剂量作用最为明显。与SLB组相比，PM组AST和ALT水平无显著性差异；SUE中、高剂量组血清的AST与ALT水平均显著性降低(P<0.05，P<0.01)；SUE低剂量组(10 mg/kg)的ALT水平显著低于SLB组(20 mg/kg)(P<0.01)；与PM组相比，SUE-40组AST和ALT水平显著性降低(P<0.05)；SUE-20组ALT水平有显著性降低(P<0.05)，AST水平有降低趋势，但无显著性差异(图2)。

3　讨论

各组小鼠实验期间体重未见明显差异，原因可能是实验时间较短，小鼠体重差异未完全显现；另外取血前各组小鼠体重均有下降趋势，原因是末次给药后小鼠禁食，导致体重略微下降[8]。

通过对各组小鼠肝体比进行比较，model组小鼠较空白组小鼠肝体比显著性升高，原因是CCl4毒性刺激使小鼠肝脏细胞肿胀变性导致小鼠肝重增加，提示造模成功[9]。而各给药治疗组与model组相比，没有统计学显著性差异，可能与实验时间较短，各受试药物未能完全逆转细胞损伤有关。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio； SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate； AST：Aspartate aminotransferase； ALT：Alanine aminotransferase

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsSLB group;?▲▲P<0.01vsPM group

CCl4肝损伤模型是研究化学性肝损伤的经典模型。CCl4进入机体后，经肝脏细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(CCl3)和三氯甲基过氧自由基(OOCCl3)，这两种自由基导致肝细胞脂质过氧化或坏死，引起细胞膜通透性改变和线粒体损伤，引起肝细胞的各种变化导致肝损伤，致使正常分布在肝组织内的AST和ALT渗漏，主要表现为血清中转氨酶活性增加[10-14]。SLB是一种抗氧自由基活性物质，其能减少CCl4的代谢激活生成的自由基并对这些自由基有清除作用，有研究证明，SLB能使CCl4对脂质的共价结合明显减少[13,14]。

本研究结果表明，SLB以及PM与model组相比表现出血清中AST水平下降，但对血清中ALT活性没有明显作用，原因可能是该给药剂量的SLB对ALT活性的降低作用不如对AST敏感，有类似研究也显示出相同结果[10]；而UDCA对AST和ALT活性降低作用不显著，可能是因为UDCA自身缺少还原基团，UDCA体内抗氧化作用可以通过增加肝细胞中谷胱甘肽和含硫醇蛋白的水平等作用实现的，机制复杂且缓慢，而在本试验时间较短所以未表现出降低血清中转氨酶的作用[15-17]。与SLB组相比，PM组在降低血清中AST和ALT活性方面没有显著性差异，因而提示仅通过简单物理混合使用SLB和UDCA不能很好的发挥二者的协同作用。

SUE组与SLB组相比可显著改善CCl4致小鼠肝脏损伤，甚至较低剂量的SUE-10降酶水平也好于SLB单独给药；此外，SUE-40和SUE-20组与PM组比较，显著降低血清AST和ALT水平，表现出较好的保肝效果，推测主要是因为将SLB与UDCA制备成共沉淀物后可显著加快SLB的溶出速率，提高其在机体内的生物利用度[7]，因此可以达到良好的保肝效果。UDCA是否能提高SLB对肝脏的靶向性，以及二者在作用靶点及通路上是否有保肝的协同作用有待进一步深入研究。

总之，将SLB和UDCA制备成共沉淀物SUE，可显著提高药效，为SLB与UDCA的联合用药提供了一种新的制剂形式。

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silybin;ursodeoxycholic acid;coprecipitate;CCl4;hepatoprotective;mice

2015-04-27

2015-10-12

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R96

A

1000-6834(2016)01-038-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.010