水飞蓟宾联合顺铂诱导人肺腺癌细胞A549凋亡及机制

毛晓敏

水飞蓟宾联合顺铂诱导人肺腺癌细胞A549凋亡及机制

毛晓敏

目的 探讨水飞蓟宾联合顺铂对人肺癌细胞A549的杀伤效应及机制。方法 将人肺癌细胞A549分别用水飞蓟宾、顺铂及两者联合干预后，采用MTT法检测不同干预方案对A549细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot法检测细胞Bcl－2与Bax的表达；利用小RNA抑制Bax的表达后，观察水飞蓟宾联合顺铂对A549细胞凋亡的诱导作用。结果 水飞蓟宾联合顺铂对A549细胞增殖的抑制率（69.9±6.8）%,凋亡率（53.5±4.2）%；水飞蓟宾对A549细胞增殖的抑制率（6.9±0.7）%，凋亡率（7.9±1.5）%；顺铂分别为（13.3±2.9）%和（16.8±2.2）%。水飞蓟宾联合顺铂治疗A549细胞的增殖抑制率和凋亡率均优于单用水飞蓟宾和顺铂治疗组（P＜0.05）。水飞蓟宾联合顺铂诱导A549细胞凋亡依赖于细胞内Bcl－2/Bax的比值，当转染Bax si RNA后，水飞蓟宾联合顺铂对A549的凋亡诱导率为（27.6±3.0）%，未转染Bax si RNA则两者联合治疗A549凋亡诱导率为（50.6±4.7）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 水飞蓟宾联合顺铂通过降低Bcl－2/Bax比例诱导人肺癌细胞发生凋亡。

人肺癌细胞A549；水飞蓟宾；顺铂；凋亡；Bcl－2/Bax

非小细胞性肺癌约占肺癌的80%[1]，我国肺癌患者5年存活率不足15%[2]。细胞毒性化疗药物是治疗肺癌的首要治疗方法，顺铂是治疗非小细胞肺癌应用最广泛的一线化疗药物之一[3]。然而大剂量化疗药物的毒副作用以及肺癌细胞逐渐产生的对化疗药物耐药性局限了化疗药物的临床使用，因此，寻找新的能增强顺铂疗效的药物显得十分必要。水飞蓟宾是从水飞蓟属植物奶蓟种子中提取的一种黄酮类化合物，其临床使用的安全性和耐受性很好，目前在美国及欧洲市场上均广泛使用[4－5]。研究发现水飞蓟宾具有良好的抗肿瘤作用，能抑制多种类型肿瘤（如乳腺癌，肺癌）细胞的生长和转移[6－7]。本文探讨水飞蓟宾联合顺铂对人肺癌细胞A549的杀伤效应及机制。

1 材料与方法

1.1 人肺癌细胞 人肺癌细胞系A549购于美国模式培养物研究所ATCC，培养在RPMI－1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。

1.2 试 剂 RPIM－1640培养基购自于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。水飞蓟宾、顺铂、MTT（噻唑蓝）、购于美国Sigma－Aldrich公司。PI和AnnexinⅤ凋亡试剂盒购自美国ebioscience公司。β－actin、Bcl－2、Bax抗体购自美国Cell signaling公司，PVDF膜购于美国Millipore公司。转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。Bax siRNA及无关对照siRNA定制于上海吉玛公司，Bax的siRNA序列为：正向：5'－GAAGCUGAGCGAGUGUCUCUU－3’，反向：5'－GAGACACU CGCUCAGCUUCUU－3’

1.3 MTT法检测细胞生长抑制率 将A549细胞接种于96孔板，设置3个复孔，分别加入10、50、100μM的水飞蓟宾，2、4、8μM的顺铂，10μM水飞蓟宾联合2μM顺铂，培养48h，对照组不加药物培养48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，往孔中加150μL二甲亚砜，震荡使紫色絮状物完全溶解，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞生长抑制率按以下公式计算：抑制率=（OD对照组－OD药物组）/OD对照组×100%。

1.4 细胞凋亡试验 在A549细胞中分别加入10μM水飞蓟宾、2μM顺铂、10μM水飞蓟宾联合2μM顺铂培养24h，对照组不加药物培养24h。收集细胞，按照试剂说明书将PI和Annexin－V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。凋亡率为Annexin V阳性细胞占所有细胞的比例。

1.5 Western bolt检测Bcl－2和Bax表达 在A549细胞中分别加入10μM水飞蓟宾、2μM顺铂、10μM水飞蓟宾联合2μM顺铂培养24h，对照组为不加药物培养24h，收集细胞，将细胞裂解后做Western blot检测Bcl－2和Bax的表达，目标蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β－actin的灰度比表示。

1.6 siRNA（小RNA）转染 按照试剂说明书操作步骤将100nM的Bax siRNA或无关对照siRNA用Lipofectamine 2000转染入A549细胞培养6h，之后再用水飞蓟宾联合顺铂治疗A549细胞，检测Bcl－2及Bax的表达，并测定细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 水飞蓟宾联合顺铂对人肺癌细胞系A549的抑制作用 水飞蓟宾和顺铂都呈剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖，当水飞蓟宾浓度达到50μM时，和10μM水飞蓟宾组相比，抗肿瘤活性明显提高（P＜0.01）。同样的，当顺铂浓度达到4μM时，和2μM顺铂组相比，抗肿瘤活性也明显提高（P＜0.01），见表1。因此我们选择10μM水飞蓟宾与2μM顺铂两者联合用药，观察对A549细胞的抑制效应，结果发现联合用药对A549细胞的抑制作用显著提高（P＜0.05），见表2。

表1 不同浓度水飞蓟宾和顺铂对A549细胞的抑制作用（±s）

表1 不同浓度水飞蓟宾和顺铂对A549细胞的抑制作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与10μM水飞蓟宾组比较，▲P＜0.01；与2μM顺铂组比较，△P＜0.01

组别对照组10μM水飞蓟宾组50μM水飞蓟宾组100μM水飞蓟宾组2μM顺铂组4μM顺铂组8μM顺铂组孔数 顺铂浓度（μM）3333333水飞蓟宾浓度（μM）0 10 50 100 000 0000248抑制率（%）0 7.5±0.8 36.8±3.2*▲60.4±5.7* 12.5±2.7* 48.4±4.5*△88.6±6.1*

表2 水飞蓟宾联合顺铂对A549肺瘤细胞的抑制作用（±s）

表2 水飞蓟宾联合顺铂对A549肺瘤细胞的抑制作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与水飞蓟宾组比较，▲P＜0.05；与顺铂组比较，△P＜0.05

组别对照组水飞蓟宾组顺铂组联合治疗组孔数 顺铂浓度（μM）3333水飞蓟宾浓度（μM）0 10 0 10 0022抑制率（%）0 6.9±0.7* 13.3±2.9* 69.9±6.8*▲△

2.2 水飞蓟宾联合顺铂对人肺癌细胞系A549凋亡诱导作用 水飞蓟宾联合顺铂可显著诱导A549细胞发生凋亡，而水飞蓟宾或顺铂单独治疗组凋亡诱导率明显较低（P＜0.01）。Western blot法检测结果显示，水飞蓟宾联合顺铂显著上调Bax表达并降低Bcl－2表达（P＜0.01），见表3。

2.3 水飞蓟宾联合顺铂对A549转染Bax siRNA后Bcl－2/Bax比值的影响 进一步研究发现A549转染Bax siRNA后Bcl－2/Bax比值显著提高（P＜0.05），且水飞蓟宾联合顺铂的凋亡诱导能力显著下降（P＜0.05），表明水飞蓟宾联合顺铂通过降低Bcl－2/Bax比值诱导A549细胞的凋亡。见表4。

表3 水飞蓟宾联合顺铂对A549细胞的凋亡诱导效应（±s）

表3 水飞蓟宾联合顺铂对A549细胞的凋亡诱导效应（±s）

注：与水飞蓟宾组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.01

组别对照组水飞蓟宾组顺铂组联合治疗组孔数3333水飞蓟宾浓度（μM）0 10 0 10顺铂浓度（μM）0022凋亡率（%）2.7±0.6 7.9±1.5 16.8±2.2▲53.5±4.2▲▲△灰度比（Bcl－2/β－actin）0.42±0.09 0.36±0.06 0.31±0.06 0.12±0.03▲▲△灰度比（Bax/β－actin）0.34±0.05 0.31±0.06 0.41±0.08 0.86±0.16▲▲

表4 Bcl－2/Bax比率对水飞蓟宾联合顺铂诱导A549细胞凋亡的影响（±s）

表4 Bcl－2/Bax比率对水飞蓟宾联合顺铂诱导A549细胞凋亡的影响（±s）

注：与水飞蓟宾联合顺铂组比较，*P＜0.05

组别对照组水飞蓟宾联合顺铂组Bcl－2 siRNA+水飞蓟宾联合顺铂组孔数Bax siRNA（nm）333 00 100无关siRNA（nm）0 100 0水飞蓟宾浓度（μM）0 10 10顺铂浓度（μM）022灰度比（Bcl－2/β－actin）0.39±0.08 0.10±0.02 0.12±0.03灰度比（Bax/β－actin）0.35±0.05 0.84±0.14 0.41±0.08* Bcl－2/Bax比值1.11 0.11 0.29*凋亡率（%）2.8±0.5 50.6±4.7 27.6±3.0*

3 讨论

顺铂是目前肿瘤治疗的一线药物，对肺癌、卵巢癌、乳腺癌等都有十分确切的疗效[8－9]，是治疗非小细胞肺癌最为有效的化疗药物，并且常常和其他药物如吉西他滨和紫杉醇等联合使用[10－11]。然而，长期大剂量应用顺铂常常造成严重的肾损害，而肿瘤细胞则逐渐耐药[12]，失去对顺铂的敏感性。

Bcl－2蛋白家族是调控肿瘤细胞凋亡的关键因子，其中Bcl－2具有抗凋亡效应，而Bax的过表达则诱导细胞的凋亡。当Bax蛋白被Bcl－2结合形成异源二聚体时，肿瘤细胞表现为抗凋亡状态，而当Bax与自身形成同源二聚体时则通过打开线粒体的膜孔道从而释放细胞色素C而诱导凋亡，因此Bcl－2/Bax比率决定着细胞是否进入凋亡程序[13－14]。在本研究中，我们发现水飞蓟宾能显著增强肺癌细胞对顺铂的敏感性，使低剂量的顺铂也能有效抑制肺癌细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡。进一步研究其机制发现两者合用可以降低Bcl－2的表达并提高Bax的表达，Bcl－2/Bax比值显著降低。用Bax siRNA将Bax基因沉默后，水飞蓟宾联合顺铂对Bax的诱导效应下降，提高了Bcl－2/Bax比值，导致对A549细胞的凋亡诱导作用下降，表明水飞蓟宾联合顺铂诱导A549细胞凋亡的机制可能是通过降低Bcl－2/Bax比值。本研究结果提示水飞蓟宾可以提高顺铂治疗肺癌的疗效，这可能成为肺癌临床治疗的新方法。

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（收稿：2014-10-06 修回：2014-10-28）

Effect of Silibinin Combined with Cisplatin on Apoptosis of Lung Cancer Cell Line A549 and Its Mecha－nism

MAO Xiaomin.People's Hospital of Jiangshan City,Quzhou(324100),China

Objective To explore anti－tumor activity of silibinin combined with cisplatin on A549 lung cancer cells and the underlying mechanism.Methods A549 cells were treated with silibinin,cisplatin and both.Cell proliferation was measured by using MTT assay.Induction of apoptosis was determined by flow cytometry.The expression of Bcl－2 and Bax was detected by Western blot.The expression of Bax was inhibited by siRNA,then the apoptosis of A549 cells was measured after treatment with both silibinin and cisplatin.Results The proliferation inhibition rate（69.9%±6.8%）and apoptosis rate（53.5%±4.2%）in silibinin combined with cisplatin group,which were significantly higher than those in silibinin group（proliferation inhibition rate 6.9%±0.7%,apoptosis rate 7.9%± 1.5%）and cisplatin group（proliferation inhibition rate 13.3%±2.9%,apoptosis rate 16.8%±2.2%）,with all P＜0.05. The effect of apoptosis induction caused by silibinin combined with cisplatin was dependent on the rate of Bcl－2/ Bax.Transecting with Bax siRNA significantly decreased the apoptosis rate induced by silibinin combined with cisplatin compared to the same treatment but without the transfection of Bax siRNA（27.6%±3.0%vs 50.6%±4.7%,P＜0.05）.Conclusion Silibinin combined with cisplatin can induce apoptosis of A549 cells via decreasing the Bcl－2/ Bax ratio.

lung cancer cell line A549;silibinin;cisplatin;apoptosis;Bcl－2/Bax

浙江省江山市人民医院检验科（江山 324100）