缺氧对人肺动脉平滑肌细胞双孔钾通道TASK-1影响及非受体酪氨酸激酶的调节作用*

田　真， 唐　碧， 蔡　鑫， 施　超， 王洪巨， 侯秀杰

(1. 济宁医学院附属医院超声科, 山东 济宁 272029； 2. 蚌埠医学院第一附属医院心血管科，3. 蚌埠医学院第一附属医院胸外科， 安徽 蚌埠 233004； 4. 阜阳市第一人民医院心血管科, 安徽 阜阳236000)



缺氧对人肺动脉平滑肌细胞双孔钾通道TASK-1影响及非受体酪氨酸激酶的调节作用*

田真1， 唐碧2△， 蔡鑫2， 施超3， 王洪巨2， 侯秀杰4

(1. 济宁医学院附属医院超声科, 山东 济宁 272029； 2. 蚌埠医学院第一附属医院心血管科，3. 蚌埠医学院第一附属医院胸外科， 安徽 蚌埠 233004； 4. 阜阳市第一人民医院心血管科, 安徽 阜阳236000)

目的：探讨缺氧对人肺动脉平滑肌细胞内向整流酸敏感性双孔钾通道(TASK-1)的影响，及非受体酪氨酸激酶(c-Src)对该过程的调节作用。方法：培养人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs)：分为正常组、缺氧30 min组、缺氧6 h组、缺氧48 h组及缺氧48 h+PP2组、缺氧48 h+PP3组和缺氧48 h+bpV组，应用流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR及Western blot方法测定不同组细胞TASK-1的mRNA及蛋白表达变化。结果：①细胞周期显示：与正常对照组相比，随缺氧时间延长，S期百分率增加；与缺氧48 h组相比，缺氧48 h+PP2组S期百分率下降；②急性缺氧6 h组TASK-1 mRNA表达增加，慢性缺氧组TASK-1 mRNA表达降低，急、慢性缺氧组TASK-1蛋白表达减少；c-Src抑制剂PP2可促进TASK-1 mRNA及蛋白表达，酪氨酸磷酯酶抑制剂bpV抑制TASK-1蛋白表达。结论：缺氧促进人肺动脉平滑肌细胞增殖，非受体酪氨酸激酶c-Src介导急、慢性缺氧对双孔钾通道TASK-1调控过程，可能与缺氧性人肺血管收缩存在一定的相关性。

人肺动脉平滑肌细胞；缺氧；双孔钾通道TASK-1；非受体酪氨酸激酶c-Src

肺源性心脏病的确切机制尚未阐明，多数认为与肺动脉收缩和重构所致的肺血管阻力增加有关[1,2]。近年研究发现[3-5]，钾通道在缺氧性肺血管收缩中发挥重要作用，相应的药物干预也纳入临床研究。双孔钾通道(TWIK-related acid-sensitive K+; TWIK, for tandem P domains in a weak inwardly rectifying K+，TASK-1)作为一种新近发现的钾通道，与缺氧性肺血管收缩发生发展的关系，成为近年研究的热点。c-Src是非受体蛋白酪氨酸激酶，近年研究发现[6,7]其在血管组织高表达，参与血管收缩、细胞增殖及缺氧应答等生理和病理过程。Nagaraj C等[8]发现Src激酶在人肺血管钾离子通道的功能方面发挥关键作用，这可能是缺氧性肺动脉高压的一个新机制。但其在急、慢性缺氧时人肺动脉收缩方面的机制及作用仍未完全阐明。为此，我们采用经典缺氧细胞培养模型[9]，复制hPASMCs急、慢性缺氧过程，运用流式细胞仪检测细胞增殖周期，RT-PCR及Western blot检测细胞TASK-1的表达变化，探讨急、慢性缺氧对人肺动脉平滑肌细胞双孔钾通道TASK-1的影响，及非受体酪氨酸激酶c-Src对该过程的作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

RPBM 1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)和生长因子(Gibco公司)，胰酶(碧云天生物公司)，Trizol(天根生物公司)，逆转录及PCR试剂盒(Fermetas公司)，RIPA裂解液(强)(碧云天生物公司)，多克隆羊抗TASK-1抗体(Santa Cruz公司)，兔抗山羊β-actin抗体(武汉博士德生物试剂有限公司)，酪氨酸激酶c-Src抑制剂PP2、PP2类似物PP3和酪氨酸磷酯酶抑制剂bpV(德国merck公司)，血气分析仪(蚌医一附院提供)，测氧仪(RSS-5100型，上海雷磁新泾仪器有限公司生产)，无菌发酵罐专用空气过滤器(sartorius Midisart 2000 17805)，凯基细胞周期试剂盒，MuseTM流式细胞分析仪等。

1.2实验方法

1.2.1人肺动脉平滑肌细胞培养肺动脉来源于安徽省蚌埠医学院第一附属医院心胸外科肺肿瘤患者切除的肺组织，患者既往无肺血管疾病或低氧血症的病史(取用标本均获得病人知情同意，符合蚌埠医学院伦理委员会规定)。利用肺动脉平滑肌组织块培养改良法原代培养肺动脉平滑肌细胞，步骤如下：在解剖显微镜下无菌分离3～4级肺小动脉(直径<1 mm)，去除血管周围的结缔组织及外膜，沿长轴剪开，显微镊轻擦去除内皮，再加入1 ml I型胶原酶的无菌培养皿内，将肺动脉剪成1 mm3左右的组织块(加入I型胶原酶目的是使组织块疏松，便于细胞爬出)，将组织块种植在25 cm3培养瓶中，予以RPBM 1640培养基+20%胎牛血清+生长因子，37℃普通CO2培养箱中培养。对数生长期时传代，予以1640培养基+10%胎牛血清培养，第3至第6代细胞用于分子生物学实验。细胞经α-SMA抗平滑肌细胞抗体免疫组织化学染色鉴定。

1.2.2缺氧模型建立参照经典缺氧模型[9]，自制可封闭的有机玻璃盒，由厚约8 mm的有机玻璃粘合而成，分底室和上盖两部分，上盖设有通气孔、出气孔和测氧孔，将种有hPASMCs的六孔板放入盒内，保持密闭，置于37℃恒温水浴箱内，盒内通入5%CO2+95%N2的混合气(气体经sartorius Midisart 2000 17805无菌发酵罐专用空气过滤器过滤)，测氧仪、氧流量计调整通气，使之保持在3%～4%的氧浓度，造模前后用血气分析检测培养基内PO2、PCO2和pH值。造模前后血气分析仪监测培养基,结果如下:常氧组pH(7.35±0.06)，PCO2(5.3±0.3) kPa，PO2(21.2±0.4) kPa；缺氧组pH(7.32±0.07)，PCO2(5.2±0.1) kPa，PO2(3.7±0.4)kPa。

1.2.3实验分组分为正常组、缺氧30 min组、缺氧6 h组和缺氧48 h组。此外，缺氧48 h组予以酪氨酸激酶c-Src抑制剂PP2、PP2类似物PP3和酪氨酸磷酯酶抑制剂bpV孵育，记为缺氧48 h+PP2组、缺氧48 h+PP3组和缺氧48 h+bpV组。

1.2.4流式细胞分析仪记录细胞周期依据凯基细胞周期试剂盒操作说明，将不同组细胞予以处理，上机进行分析，细胞周期结果由MuseTM细胞软件分析。

1.2.5RT-PCR方法检测TASK-1的mRNA表达实验组分别收集约1×106个细胞，采用Trizol 一步法提取总RNA，随机引物逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。目的基因TASK-1上游引物：5’-CGGCAAGGTGTTCTGCATG -3’；下游引物：5’-CAAGGTGTTGATGCGCTCG-3’；扩增片断长度91 bp。内参基因β-actin上游引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG -3’；下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’；扩增片段长度205 bp。扩增条件:95℃预变性5 min；95℃ 30 s变性，59.9℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸，反应35个循环；最后72℃延伸10 min，样本置20℃备用。将TASK-1及β-actin的PCR产物各5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，GIS 凝胶处理系统拍摄记录，图像分析软件对条带光密度进行扫描，以目的基因与内参基因平均光密度比值(TASK-1/β-actin) 进行半定量分析。

1.2.6Western blot方法检测TASK-1的蛋白表达实验组分别收集约1×106个细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清测定蛋白浓度。根据样品浓度以总蛋白50 μg 上样，电泳后转至PVDF 膜，Western封闭液封闭1 h，分别孵育TASK-1、β-actin，一抗4℃过夜，次日TBST 洗膜3次，每次5 min，分别予以TASK-1、β-actin二抗，37℃室温孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次5 min，millipore显影液进行显影。凝胶成像系统记录条带的光密度，得出TASK-1蛋白表达量的校正值(即TASK-1条带与β-actin条带的净光密度之比)。

1.3统计学处理

2　结果

2.1hPASMCs细胞培养及免疫组织化学鉴定

原代培养约3～4周可见到组织块周围hPASMCs呈峰谷样成长(图1A)，细胞经α-SMA免疫组化证实为平滑肌细胞，纯度95%以上(图1B)。

Fig. 1A: hPASMCs appeared the typical “hill and valley” (×40); B: Immunohistochemical staining for smooth muscle cell(Evision ×200)

2.2不同组hPASMCs细胞周期的变化

与正常组比较，缺氧30 min组hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；与缺氧30 min组比较，缺氧6 h组hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；与缺氧6 h组比较，缺氧48 h组hPASMCs的S期百分率增加(P<0.01)；与缺氧48 h组比较，缺氧48 h+PP2组hPASMCs的S期百分率下降(P<0.01，图2、表1)。

2.3不同组hPASMCs中TASK-1基因表达的变化

与正常对照组比较，缺氧30 min组TASK-1 mRNA表达无显著性差异，而急性缺氧6 h组TASK-1的基因表达增加(P<0.05)，慢性缺氧48 h组表达减少(P<0.01)；慢性缺氧48 h+PP2孵育组较48 h组表达增加(P<0.01，图3，表2)。

2.4不同组hPASMCs的TASK-1蛋白表达的变化

与正常对照组比较，缺氧30 min组、急性缺氧6 h组及慢性缺氧48 h组TASK-1蛋白表达均明显减少(P<0.01)；慢性缺氧48 h+PP2孵育组较48 h组表达增加(P<0.01)，慢性缺氧48 h+PP3孵育组较48 h组表达无显著性差异，慢性缺氧48 h+bpV组孵育组较48 h组表达下降(P<0.01，图4，表3)。

Fig. 2Effects of hypoxia on the hPASMCs cycle(n=5)

A: Con； B: Hypoxia 30 min； C: Hypoxia 6 h； D: Hypoxia 48 h； E: Hypoxia 48 h+PP2

GroupPercentageofcellsinSphases(%)Con10.2±0.4Hypoxia30min11.6±0.5**Hypoxia6h13.1±0.2##Hypoxia48h16.9±0.4△△Hypoxia48h+PP213.1±0.3▲▲

**P<0.01vsCon；?##P<0.01vsHypoxia 30 min；?△△P<0.01vsHypoxia 6 h；?▲▲P<0.01vshypoxia 48 h

Fig. 3Effects of hypoxia on the TASK-1 mRNA expression in human pulmonary artery smooth muscle cells(n=5)

1: Con； 2: Hypoxia 30 min； 3: Hypoxia 6 h； 4: Hypoxia 48 h； 5: Hypoxia 48 h+PP2； M: Marker

*P<0.05,?**P<0.01vsCon；?##P<0.01vsHypoxia 48 h

Fig. 4Effects of hypoxia on the TASK-1 protein expression of human pulmonary artery smooth muscle cells(n=5)

1: Con, 2: Hypoxia 30 min, 3: Hypoxia 6 h, 4: Hypoxia 48 h; 5: Hypoxia 48 h+PP2, 6: Hypoxia 48 h+PP3, 7: Hypoxia 48 h+bpV

GroupTASK-1/β-actinCon0.90±0.02Hypoxia30min0.75±0.01**Hypoxia6h0.65±0.01**Hypoxia48h0.49±0.023**Hypoxia48h+PP20.57±0.019##Hypoxia48h+PP30.50±0.014Hypoxia48h+bpV0.46±0.010##

**P<0.01vscon；?##P<0.01vshypoxia 48 h

3　讨论

缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)是机体的一项重要代偿反应，通过局部肺泡缺氧时肺小阻力血管收缩实现通气-血流重新分配,同时缺氧可作为信号启动一系列级联细胞增殖，诱导血管平滑肌细胞增殖和重塑。因此肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡失衡在肺血管重塑发生、发展过程中起到关键作用。新近研究发现[10]，钾离子通道在平滑肌细胞增殖和凋亡中发挥关键作用。缺氧抑制一些钾通道(如电压门控钾通道和TASK通道)[11.12]，使细胞膜去极化和钙离子内流，最终导致肺血管收缩[13]。本课题组前期研究发现[12]，钾通道TASK-1在人肺动脉平滑肌细胞高表达，急性缺氧后TASK-1电流减少，c-Src抑制剂PP2孵育后缺氧敏感性TASK-1电流消失，提示c-Src可能介导TASK-1参与缺氧性肺血管收缩[8]。

本实验模拟经典缺氧模型，对hPASMCs进行急、慢性缺氧培养，考虑到急性缺氧膜片钳研究时间一般为30 min，而洪志刚[5]等对急性缺氧时鼠Kv钾通道研究为6 h，其表达结果存在争议，本文将急性缺氧分为30 min和6 h组，慢性缺氧组设为48 h。借助流式细胞仪检测不同组hPASMCs的细胞周期发现，随缺氧时间延长，hPASMCs的S期百分率增加，处于DNA复制期细胞数增多，提示细胞增殖力逐渐增加，表明缺氧促进hPASMCs的增殖。而孵育c-Src特异性抑制剂PP2抑制缺氧48 h组hPASMCs的S期百分率，处于DNA复制期细胞数减少，这些结果提示c-Src调节缺氧性人肺血管平滑肌细胞的增殖过程。

本文通过RT-PCR技术研究发现，在缺氧不同阶段人肺动脉平滑肌细胞上均有双孔钾通道TASK-1 mRNA的表达，缺氧30 min组较正常组TASK-1 mRNA表达无显著性差异，缺氧6 h组较正常组TASK-1 mRNA表达增加，而缺氧48h组较正常组TASK-1 mRNA表达显著减少。可以推测，短暂缺氧hPASMCs的基因调控机制尚未启动，而缺氧6 h组较正常组TASK-1钾通道基因表达增加，与洪志刚等[5]对Kv钾通道基因的研究相一致。据既往研究[14]，我们推测可能是由于短期调控内存在某种转录后表达，通过microRNA或是磷酸化修饰等过程调节，其具体机制仍有待我们进一步研究。缺氧48 h组较正常组TASK-1 mRNA表达显著下降，这表明慢性缺氧抑制TASK-1 mRNA表达。

采用Western blot技术检测，发现双孔钾通道TASK-1蛋白亦表达于缺氧不同时间段的人肺动脉平滑肌细胞，缺氧30 min组较正常组TASK-1蛋白表达下降；缺氧6 h组较缺氧30 min组TASK-1蛋白表达下降；缺氧48 h组较缺氧6 h组TASK-1蛋白下降。这些结果表明缺氧抑制TASK-1蛋白的表达。

此外，本文发现，缺氧48 h组予以c-Src抑制剂PP2孵育后，TASK-1 mRNA及蛋白表达明显增加。缺氧48 h组予以酪氨酸磷酯酶抑制剂bpV孵育后，TASK-1蛋白表达下降；而无活性的PP2类似物PP3对其无影响。这些结果表明酪氨酸激酶c-Src调节双孔钾通道TASK-1的表达，并且介导急、慢性缺氧性人肺血管收缩反应。

研究发现肺动脉高压患者PASMC中Src的磷酸化增加,Src激酶和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)可共同作用抑制PASMC的有丝分裂和细胞迁移，抑制肺血管结构重塑[15]。c-Src抑制剂PP2减少白细胞的炎性浸润、凋亡性细胞死亡及血纤维蛋白沉积，有效逆转再灌注后急性肺损伤[16]。Gomes等[17]发现PP2可导致Kv4.3电流减少，胞内给予重组c-Src或bpV可增加该电流。另报道[18]，在HEK293细胞中，Src和Kv1.5的共同表达抑制Kv1.5电流。研究发现[19]c-Src抑制剂激活鼠冠状动脉细胞上Kca通道，酪氨酸磷酸酯酶抑制剂抑制Kca通道。Uzun等发现绵羊肺动、静脉血管环HPV过程与酪氨酸激酶功能密切相关[20]。此外Knock等发现[21]血管收缩剂所致鼠肺血管张力增加的过程是Src依赖性的，PP2抑制HPV，缺氧可以增强Src Tyr-416蛋白磷酸化，并且胞内钙离子浓度增加可被PP2或c-Src siRNA阻断。Kirkegaard SS等在埃利希腹水瘤细胞中发现TASK-2通道表达，其钾离子外流受PP2调节，并与酪氨酸磷酸化过程相关[22]。近年一些研究发现，酪氨酸激酶可能作用于钾通道。然而这些研究大多在细胞系或异源表达系统使用广泛抑制剂，并没有表明其对钾通道产生的生理作用[22]。

前期研究[8]发现钾通道TASK-1和c-Src在人肺动脉平滑肌细胞共表达，c-Src抑制剂PP2抑制TASK-1电流，提示c-Src可能参与肺动脉平滑细胞TASK-1的调节。本实验研究发现，在急、慢性缺氧时hPASMCs均有TASK-1表达，且慢性缺氧时予以PP2孵育后TASK-1表达显著增加，bpV对TASK-1蛋白表达的作用与PP2相反，而无活性的PP2类似物PP3对其蛋白表达无影响。细胞周期水平PP2抑制慢性缺氧后hPASMCs增殖。这些结果表明c-Src通过调控钾通道TASK-1不仅在急性HPV，而且在慢性HPV中均发挥着关键作用。

Knock等[6.21]在鼠肺动脉发现PP2抑制HPV，缺氧通过磷酸化Src调节钾通道的功能表达，与先前急性缺氧时在人肺动脉平滑肌细胞上的研究相一致[8]。这提示c-Src可能通过磷酸化TASK-1介导缺氧性人肺血管收缩反应，对于其磷酸化位点的表达仍有待进一步研究。

本研究发现，双孔钾通道TASK-1在急、慢性缺氧性人肺血管平滑肌细胞中均有表达，酪氨酸激酶c-Src调节TASK-1的表达，可能与缺氧性人肺血管收缩有一定的相关性。但对于其相关信号通路我们并未完全阐明，其转录后修饰及磷酸化通路仍有待进一步研究。

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The effect of hypoxia on pulmonary artery smooth muscle cells two pore domain potassium channels TASK-1 and the regulation of non-receptor tyrosine kinases

TIAN Zhen1, TANG Bi2△, CAI Xin2, SHI Chao3, WANG Hong-ju2, HOU Xiu-jie4

(1. Department of Ultrasound, The Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029； 2. Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 3. Department of Thoracic Surgery, Bengbu 233004;4. Department of Cardiovascular Medicine, The First People's Hospital of Fuyang, Fuyang 236000, China)

Objective: To investigate the effect of hypoxia on the human pulmonary artery smooth muscle cells two pore domain potassium channels TASK-1 and the regulation of non-receptor tyrosine kinase c-Src in this process. Methods: The cultured human pulmonary artery smooth muscle cells(hPASMCs) were divided into: normal group, hypoxia 30 minute group, hypoxia 6 hours group and hypoxia 48 hour group,and hypoxia 48 hour+PP2 group, hypoxia 48 hour+PP3 group, hypoxia 48 hour+bpV group. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle, RT-PCR and Western blot technique were carried out to detect the expression changes of TASK-1 mRNA and protein in different groups. Results: ①Cell Cycle Show: Compared with normal control group, with prolonged hypoxia, the percentages of hPASMCs in S phases of cell cycle were increased. While compared with hypoxia 48 hour group, the percentages of hypoxia 48 hour+PP2 group hPASMCs in S phases of cell cycle were decreased.②The expression of TASK-1 mRNA on hPASMCs in acute hypoxia 6 hour group was increased, while the expression of TASK-1 protein on hPASMCs in the acute and chronic hypoxia group was decreased, and the expression of TASK-1 mRNA on hPASMCs in the chronic hypoxia group was decreased;After pre-incubation of a potent and selective inhibitor of the Src family of protein tyrosine kinases PP2, the expression of TASK-1 mRNA and protein in hypoxia 48 hour group was increased, however after pre-incubation of the inhibitor of the Src family of protein tyrosine phosphatase bpV, the expression of TASK-1 protein in hypoxia 48 hour group was decreased. Conclusion: Hypoxia promotes human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation, and non-receptor tyrosine kinase c-Src may participate in the expression of two pore domain potassium channels TASK-1 regulated by hypoxia. Therefore, we hypothesized that TASK-1 channels and c-Src participatein the acute and chronic hypoxic human pulmonary vasoconstriction.

human pulmonary artery smooth muscle cells;hypoxia;two pore domain potassium channels TASK-1;non-receptor tyrosine kinase c-Src

国家自然科学基金(81170046)；教育部“留学回国人员科研启动基金”(第46批)

2015-04-30

2015-10-21

△Tel：15855798487； E-mail: bitang2000@163.com

R543.2

A

1000-6834(2016)01-026-06

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.07