β3肾上腺素能受体对大鼠胸主动脉平滑肌舒缩活动的影响及其机制*

李晓鹏， 赵倩倩， 杨　岚， 李海清， 崔香丽

(山西医科大学生理学系， 省部共建细胞生理学重点实验室， 太原 030001)



β3肾上腺素能受体对大鼠胸主动脉平滑肌舒缩活动的影响及其机制*

李晓鹏， 赵倩倩， 杨岚， 李海清， 崔香丽△

(山西医科大学生理学系， 省部共建细胞生理学重点实验室， 太原 030001)

目的：观察激动β3-肾上腺素能受体(β3-AR)对大鼠胸主动脉平滑肌舒缩活动的影响及其可能机制。方法：30 mmol/L高钾生理盐溶液预收缩去内皮大鼠离体胸主动脉后，观察β3肾上腺素能受体激动剂BRL37344(BRL)对主动脉舒缩活动的影响。用SR59230A (SR)、普萘洛尔(Pra)、L-NNA、H-89以及Iberiotoxin (IBTX)预孵主动脉平滑肌，探讨其可能存在的作用机制;应用免疫组织化学法，观察β3-AR在大鼠胸主动脉的分布。结果：①BRL对预收缩的去内皮大鼠胸主动脉产生显著的舒张作用，舒张百分比为(10.59±0.79)%；② 大鼠胸主动脉组织切片中可以观察到β3-AR在内皮和平滑肌层都有表达；③ 给予Pra后，BRL对血管的舒张百分比无显著性变化; SR能明显拮抗BRL的血管舒张作用；④ 用L-NNA阻断NOS或者H-89抑制PKA后，BRL对血管的舒张作用有不同程度的减弱；⑤ IBTX阻断大电导钙依赖性钾通道后，BRL对血管的舒张作用减小。结论：激动β3-AR产生血管舒张作用，平滑肌β3-AR的作用与NOS以及PKA信号转导途径有关，是通过影响大电导Ca2+依赖性钾通道(BK通道)来实现的。

大鼠；β3肾上腺素能受体；主动脉；平滑肌；NOS；PKA；Ibriotoxin

1989年β3-AR作为区别于β1、β2受体的新型肾上腺素能β受体被成功克隆，之后相继在体内多种组织如脂肪组织、循环、呼吸、泌尿和生殖等系统中均有发现。在正常心肌组织，β3-AR介导负性肌力作用，使心脏的收缩能力下降[1]，在心力衰竭的心肌组织则可能会因为心衰程度的不同产生负性或正性的肌力作用[2]；在小肠、子宫和膀胱平滑肌中，β3-AR同样也能介导平滑肌的负性肌力作用，引起小肠、子宫和膀胱平滑肌的舒张[3-5]，对于β3-AR在血管的分布则有种属和部位的差异。对于大鼠胸主动脉，Trochu JN等的研究发现SR58611和CGP12177能引起大鼠胸主动脉剂量依赖性的舒张，且去除内皮这种舒张作用明显减弱，提示β3-AR主要存在于胸主动脉内皮层，受体的激动能产生血管舒张作用[6]；Brawley L等的研究应用多种β受体激动剂如异丙肾上腺素、CGP12177、ZD2079等同样证明了大鼠胸主动脉存在β1、β2受体以及非典型肾上腺素能β受体(β3、β4)的存在，这些受体协同产生舒张血管的作用[7]。在心肌组织，β3-AR的激动能活化Gi蛋白，继而激活NOS-NO途径作用(主要是通过eNOS)于L型Ca2+通道等靶点通过影响心肌细胞膜电位以及兴奋收缩耦联过程从而实现负性肌力作用[8]，而且能够通过降低β1受体的谷胱甘肽化以及钠钾泵的激活实现严重心力衰竭时转运出细胞内部多余的Na+起到正性肌力作用以及保护心肌细胞和代偿作用[9]。在膀胱平滑肌，β3-AR的激动能够增大BK通道STOC(自发的短暂的外向BK通道电流)开放频率，使膜电位超极化而舒张平滑肌[10]。对于大鼠胸主动脉内皮和平滑肌层到底有无功能性的肾上腺素能β3受体存在一定的争议，仅仅只针对大鼠胸主动脉平滑肌层有无β3-AR的研究相对较少，其下游信号转导途径以及离子通道靶点的研究也不甚明确，本课题组旨在研究去内皮大鼠胸主动脉平滑肌层中β3-AR是否有分布、其在血管舒缩活动中的作用及可能的信号转导机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级SD大鼠，雄性，180～220 g，100只，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(SCXK(京)2009～0019)提供。大鼠在12 h∶12 h明暗交替、室温 22℃～25℃、湿度50%～60%的环境中饲养，自由饮食与饮水，受试动物在动物观察室内饲养两周后开始实验。

1.1.2试剂ACh((CH3)3N+CH2CH2OCOCH3C l-)、BRL37344(±)-(R,R)-[4-[2-[[2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]phenoxy]acetic acid sodium hydrate)、Propranolol((R)-1-(异丙基氨基)-3-(1-萘氧基)-2-丙醇盐酸盐C10H7OCH2CH(OH)CH2NHCH(CH3)2·HCl)、SR59230A(3-(2-Ethylphenoxy)-1-[[(1S)-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl]amino]-(2S)-2-propanol oxalate salt)、L-NNA(L-NNA N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid NG-NO2-L-Arg)、H-89(N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride)、IBTX(C179H276N50O56S7)、DMSO均购于美国Sigma公司。其他试剂购自上海生工生物工程有限公司。β3受体抗体购自上海博研生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主动脉环实验

1.2.1.1大鼠胸主动脉环的制备及内皮完整性检测：取SD大鼠，断头处死，迅速打开胸腔，分离胸主动脉，将取下的胸主动脉放入4℃的生理盐液(PSS液)(NaCl 144，KCl 5.8，MgCl21.2，CaCl22.5，Glucose 11.1，HEPES 5，单位mmol/L,以1 mol/L的NaOH调节pH至7.4)，小心剪去血管周围的脂肪组织和结缔组织，将胸主动脉剪成3～4 mm的血管环，若去内皮时则用与血管内径相适应的棉棒从管腔擦过，然后用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管环，水平悬挂于10 ml浴槽中，下方固定，上方通过一根细钢丝悬挂于张力换能器。应用Powerlab生物信号采集系统记录血管张力。浴槽中注有37.5℃、通入100%O2、pH调节为7.4的PSS液。调整血管位置至水平，使其各部分所受张力平衡，其后调节前负荷至2 g，平衡1 h，期间每15 min换一次PSS液。待血管张力稳定后，每组血管环均用30 mmol/L KCl PSS液刺激两次，当血管环对刺激稳定即两次同样的刺激所引起的收缩幅度差距小于10%时，换液两次。需要检验内皮完整性时，用10-5mol/L去甲肾腺素溶液刺激血管，收缩达到平台期后，加入ACh(浴槽内终浓度为10 μmol/L)检验血管内皮完整程度，若ACh引起的舒张程度大于70%，则认为内皮保存完整；若ACh引起的舒张程度小于预收缩的5%时，认为内皮已完全去除。

1.2.1.2各种药物在血管环实验中的应用已检验合格的大鼠正常以及去内皮胸主动脉，经30 mmol/L KCl PSS液刺激达到平台期后，累积加入BRL37344使浴槽中的终浓度依次递增为10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L、3×10-6mol/L、10-5mol/L，记录不同浓度下血管环的张力，计算张力变化值，计算各个浓度下舒张百分比(设定30 mmol/L KCl PSS引起的最大收缩幅度为100%，加入药物后引起的血管舒张幅度与KCl诱导的最大幅度的比率即为舒张百分比)。同样的方法记录一次性加入BRL37344使浴槽中终浓度为10-5mol/L时的血管张力，并计算舒张百分比。对于Pra、SR59230A、L-NNA、H-89以及IBTX这些阻断剂和抑制剂，在预收缩前先孵育10 min，预收缩达到平台期后加入10-5mol/L的BRL37344，记录血管张力并计算舒张百分比。

1.2.1.3溶剂时间对照已检验合格的大鼠正常以及去内皮胸主动脉，经30 mmol/L KCl PSS液刺激稳定后加入0.1 μl DMSO(BRL37344和SR59230A初步溶解所用)作为溶剂对照，终体积浓度为0.2‰。待张力曲线稳定20 min作为溶剂时间对照。

1.2.2免疫组织化学法断头处死大鼠后，迅速剪下胸主动脉置于4℃的PSS液，仔细剥离血管周围的脂肪和结缔组织，浸入福尔马林溶液进行固定。其后进行蜡块包埋，切片厚度5 μm，再经过脱蜡、抗原修复、孵育兔抗鼠抗β3受体抗体一抗、二抗试剂盒、加SABC封闭以及DAB显色剂显色后，镜下观察β3受体的表达。

1.3统计

2　结果

2.1大鼠胸主动脉环内皮完整性检测

加入终浓度为10 mmol/L的乙酰胆碱后，内皮完整的大鼠胸主动脉环血管环立即出现明显的舒张效应，且在5 min内达到平台期，舒张百分比不小于70%；用棉棒擦去内皮的大鼠胸主动脉环张力曲线则保持平稳，并无衰减迹象，10 min内舒张百分比小于5%(图1)。

Fig. 1Checking the endothelium integrity of rat thoracic aorta rings

2.2BRL37344对KCl预收缩内皮完整和去内皮大鼠胸主动脉环的影响

BRL37344对内皮完整和去内皮大鼠胸主动脉产生剂量依赖性的舒张作用，与内皮完整组相比，BRL对去内皮大鼠胸主动脉环产生的舒张量效曲线Emax明显减弱(P<0.01)量效曲线右移。内皮组和去内皮组BRL产生的最大舒张百分比Emax分别为(24.51±0.55)、(11.86±2.20)(图2)。

2.3SR59230A和Propranolol对BRL37344舒张作用的影响

一次性加入BRL37344，使浴槽中终浓度为10 μmol/L，30 min内其对血管产生明显的舒张作用，且达到平台期，舒张百分比为(10.59±0.79)；预孵SR59230A(选择性β3-AR阻断剂)后，BRL对血管的舒张效应受到明显抑制(P<0.01)，舒张百分比为(1.63±0.58)；预孵Propranolol(β1、β2受体阻断剂)后，BRL对血管的舒张效应基本无变化(P>0.05),舒张百分比为(10.41±0.85)(图3)。

Fig. 2The effect of BRL37344 on the thoracic aorta rings pre-contracted by KCl with or without endothelium (n=7)

**P<0.01vsendothcllum

Fig. 3BRL37344 relaxes thoracic aorta smooth muscle via activation of β3adrenoceptors(n=6)

A：BRL； B：BRL37344 relaxes thoracic aorta smooth muscle in presence of Pra; C：SR inhibits the relaxation effect of BRL； D：Action of BRL on thoracic aorta smooth muscles in presence of Pra and SR

**P<0.01vsBRL group

2.4预孵H-89和L-NNA后，BRL37344对预收缩去内皮大鼠胸主动脉环的影响

为了探究β3-AR的信号转导机制，本实验采用预孵H-89(PKA抑制剂)、L-NNA(NOS抑制剂)后，BRL的舒血管效应有了不同程度的减弱(P<0.05，P<0.01，图4)，且L-NNA对BRL37344的影响更大，其舒张百分比分别为(7.84±0.80)、(3.68±0.47)。

2.5预孵IBTX后，BRL37344对预收缩去内皮大鼠胸主动脉环的影响

预孵IBTX(选择性大电导钙离子依赖性钾通道阻断剂)，使浴槽中终浓度为200 nmol/L，高钾刺激血管待张力稳定后加入终浓度为10 μmol/L的BRL37344，这时血管张力降低较显著，BRL产生的血管舒张百分比较单独加入BRL减小，这提示预孵IBTX阻断BK通道能够明显阻断 BRL对血管的舒张效应(P<0.01)，预孵IBTX后BRL产生的血管舒张百分比(4.57±0.30)(图5)。

Fig. 4Relaxation of β3-AR on thoracic aorta smooth muscle are related to activation of NOS and PKA signaling pathway (n=6)

*P<0.05，**P<0.01vsBLR group

Fig. 5β3adrenoceptors relax aorta smooth muscle via activation of large-conductance Ca2+-dependent potassium channels (n=6)

**P<0.01vsBLR group

2.6溶剂对本实验结果的影响

加入DMSO 30 min，可观察到血管张力曲线平稳，基本不发生衰减，舒张百分比为(0.007±0.002)，且与各组实验结果相比，统计学差异显著(P<0.01，表1)。

Tab. 1Relaxation percentage of BRL37344 on thoracic aorta smooth muscle

GroupRelaxation(%) nControl0.007±0.0025BRL10.59±0.79**6SR+BRL1.63±0.58**6

**P<0.01vscontrol group

3　讨论

本实验通过形态学和功能学研究证明了β3-AR在大鼠胸主动脉内皮和平滑肌层均有存在，激动β3-AR能产生舒张血管的效应。β3-AR最早发现于脂肪细胞，主要参与脂肪组织甘油三酯的降解。其后逐渐被发现在很多系统中都有分布。在心肌组织中β3-AR激活能够产生心肌的负性肌力作用[11]。对大鼠胸主动脉β3-AR的研究有两种截然不同的观点：一种认为大鼠胸主动脉中存在有功能的β3-AR，且能产生血管舒张作用；另一种观点是大鼠胸主动脉中并不存在有生物活性的β3-AR，异丙肾上腺素的作用不能被β1、β2受体阻断剂阻断是因为可能阻断了α受体[12]。因此大鼠胸主动脉有无功能性的β3-AR仍不明确。本实验应用选择性β3-AR激动剂BRL37344，观察到BRL37344对内皮完整和去内皮的胸主动脉都能够产生有剂量依赖性的舒张效应，且BRL37344对去内皮的胸主动脉环产生的血管舒张作用明显较内皮完整的胸主动脉环降低，提示在大鼠胸主动脉的内皮和平滑肌层都可能存在有生物活性的β3-AR，且内皮所产生的舒张作用在β3-AR受体激动产生的血管舒张效应中占主要作用。BRL37344在大剂量应用时有激动β1受体的作用，为了排除β1受体对实验结果的干扰，本文采用较高浓度的β3-AR阻断剂SR59230A以及β1、β2受体阻断剂Propranolol预孵主动脉血管。预孵SR59230A阻断β3-AR，BRL37344舒张血管的作用明显受到拮抗；而预孵Propranolol阻断了β1、β2受体，BRL37344对血管的舒张百分比无显著改变，提示BRL37344对大鼠胸主动脉平滑肌层的作用是通过激动β3-AR来实现的，与β1、β2受体无关(图3)。累积浓度的BRL37344所产生的浓度梯度也存在时间依赖性，浓度越高，达到最大效应的时间也越长。考虑到存在时间衰减的问题，本实验采用一次性加入同等浓度的BRL37344，以排除时间衰减造成的误差。结果显示一次性加入终浓度为10 μmol/L的BRL37344，血管张力曲线在30 min内即可达到平台期。本实验同样在高钾刺激的基础上加入DMSO(溶解BRL37344相同剂量)，观察到血管张力平稳，不存在溶剂对实验结果的干扰。

在心肌组织中，β3-AR的激动能使NO的含量增加，其后作用于许多能够影响心肌细胞膜电位的离子通道[13]，如钠钾泵等[14]，使心肌收缩能力减弱。在大鼠胸主动脉内皮细胞中，Gi的活化会激活NOS途径，引起平滑肌的舒张。有研究表明胸主动脉内皮细胞β3-AR的下游信号分子也为NOS。在人膀胱平滑肌β3受体的研究中，也发现β3-AR激动能够影响膀胱平滑肌细胞中PKA的活化[10]；在大鼠门静脉平滑肌细胞中，β3-AR兴奋可以通过激活Gαs激活cAMP/PKA通路[15]。而β3-AR激动后也能影响胞内cAMP水平[16]，而且β3-AR与β1受体有一定的同源性，因此推测大鼠胸主动脉平滑肌细胞β3-AR的信号转导途径可能也与PKA有关。本实验应用NOS抑制剂L-NNA和PKA抑制剂H-89观察到BRL产生的血管舒张百分比较单纯应用BRL组均有不同幅度的下降, 提示β3-AR激动后产生的血管舒张作用与NOS和PKA信号转导途径有关。

膜电位的调节是血管张力的主要调节因素，钾通道的开闭可以影响膜电位去极化或者超极化，进而调节血管舒缩活动。在膀胱平滑肌，激动β3-AR通过增加BK通道的开放频率使膜电位超极化而舒张平滑肌；在肺血管床中，β3-AR可以通过NO的释放增加和激活BK通道、KCa钾通道而舒张血管[16]。可见BK通道在平滑肌舒缩活动的调节中有着很大的作用。本实验选用BK通道抑制剂IBTX作用于血管平滑肌，观察BRL37344对去内皮大鼠胸主动脉的作用，观察到预孵IBTX后， BRL37344的舒血管效应降低。提示BRL37344的作用与BK通道的活性有关，激动β3-AR引起血管平滑肌舒张是通过BK通道的开放实现的。

综上所述，本研究证明在平滑肌层中的β3-AR可以通过PKA和NOS途径，并可能影响BK通道来实现平滑肌的舒张效应。本研究为临床上高血压心力衰竭等疾病的治疗提供了靶点。但NOS和PKA信号转导途径是如何影响BK通道以及BK通道的活性会如何变化还需进一步研究。

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Effects of β3adrenoceptors on the contractility of rat thoracic aorta smooth muscle and the mechanism

LI Xiao-peng, ZHAO Qian-qian, YANG Lan, LI Hai-qing, CUI Xiang-li△

(Department of Physiology, Shanxi Medical University, Cell Physiology Key Laboratory of Provice and Ministry, Taiyuan 030001, China)

Objective: To observe the effect of β3adrenoceptors (β3-AR) activation on rat thoracic aorta smooth muscle contractility and the possible related mechanism. Methods: The endothelium removed thoracic aorta was pre-contracted with 30 mmol/L KCl physiological saline solution (PSS). Then the tension of the thoracic aorta was recorded in presence of BRL37344 (BRL) to determine the action of β3-AR. The tension of the thoracic aorta was also recorded in the presence of Propranolol (PRA), SR59230A (SR), L-NNA, H-89 and Iberiotoxin (IBTX) respectively to reveal the underling mechanism of β3-AR activation on rat vascular smooth muscle. Immunohistochemistry was adopted to confirm the existence and the distribution of β3-AR in rat thoracic aorta. Results: The results showed that:①The thoracic aorta was relaxed by β3-AR activation, with a relaxation percentage of (10.59±0.79). ②β3-AR was expressed in both endothelial and smooth muscle layer in thoracic aorta sections of rats. ③ PRA did not block the effect of BRL on the thoracic aorta. The relaxation actions of BRL could be antagonized by pre-incubating the thoracic aorta with SR. ④ L-NNA (a NOS inhibitor) and H-89 (a PKA inhibitor) reversed the relaxation effect of BRL on vascular smooth muscle. ⑤The effect of BRL was decreased after application of Ibriotoxin (IBTX), a large conductance calcium dependent potassium channel blocker. Conclusion: The results confirmed that activation of β3-AR led to relaxation of thoracic aorta smooth muscle. The relaxation action of β3-AR on smooth muscle of rat thoracic aorta was related to activation of NOS and PKA signaling pathway. Large conductance Ca2+-K+channels were involved in the relaxation action of β3-AR activation on rat thoracic aorta smooth muscle.

β3adrenoceptors;aorta;smooth muscle;NOS;PKA;Ibriotoxin

山西省自然科学基金(2012011040-8)；山西医科大学科技创新基金([2012]11号)

2015-04-03

2015-06-15

△Tel: +86-0351-4135075; E-mail: cuixlcxl@sina.com

R331.3

A

1000-6834(2016)01-069-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.018