苦参碱对体外人髓母细胞瘤D341细胞凋亡、增殖及凋亡相关蛋白的影响*

周开宇， 吉海龙， 史鹏飞

(温州医科大学第一临床医学院 神经外科， 浙江 温州 325000)



苦参碱对体外人髓母细胞瘤D341细胞凋亡、增殖及凋亡相关蛋白的影响*

周开宇△， 吉海龙， 史鹏飞

(温州医科大学第一临床医学院 神经外科， 浙江 温州 325000)

目的：探讨苦参碱在体外对人髓母细胞瘤D341细胞的凋亡、增殖作用及相关蛋白Caspase 3、Caspase 9表达的影响。方法：D341细胞体外成功培养后，按所加苦参碱的浓度进行分组(0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml， 0 mg/ml为对照组)，各实验重复3次。光学显微镜、透射电镜观察细胞形态、结构的改变，CCK-8法检测D341细胞增殖的影响，Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡。Western blot检测苦参碱作用D341细胞后Caspase 3、Caspase 9蛋白表达水平的改变。结果：在苦参碱作用下，细胞增殖的抑制率随药物浓度的增加而逐渐升高，抑制率有统计学差别(P<0.01)；药物作用时间不同对细胞增殖的抑制程度不同，24 h与72 h组的抑制率有统计学差别(P<0.01)。瘤细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而逐渐升高，0.5 mg/ml、1.0 mg/ml与1.5 mg/ml、2.0 mg/ml组间的差别均有统计学意义(P<0.05)；瘤细胞的凋亡率随着作用时间延长而升高，24 h与72 h、48 h与72 h组间的凋亡率的差别有统计学意义(P<0.05)。随着苦参碱浓度的增加，细胞Caspase 3 和Caspase 9的表达均逐渐增强(P<0.01)。结论：苦参碱在体外对D341细胞是通过上调Caspase 3和Caspase 9蛋白来发挥其促凋亡、抑制增殖作用。【关键词】 苦参碱；人髓母细胞瘤D341细胞；凋亡；增殖；Caspase 3；Caspase 9

中药在我国医药经济中独具特色，一直是新药先导化合物和新药发现的重要资源。目前，人们对苦参碱药物作用研究较多[1]。但是，苦参碱对于人髓母细胞瘤细胞的作用人们知之很少。髓母细胞瘤是一种好发于儿童后颅窝的恶性程度极高的肿瘤，占儿童颅内肿瘤的第二位 (18%～20%)，手术可切除，但较易复发，预后较差[2]。因此，找寻一种对此肿瘤有效的抗瘤药物具有很好的临床应用前景。本研究探讨人髓母细胞瘤细胞系D341细胞在苦参碱作用下Caspase 3、Caspase 9相关蛋白的变化，通过体外实验检测苦参碱对D341细胞的作用，为探索中成药对人髓母细胞瘤的治疗提供一点思路。

1　材料与方法

1.1材料

细胞株D341由北京协和医院细胞库提供，苦参碱由宁波天衡制药有限公司提供，光镜采用日本Nikon倒置相差显微镜，透射电子显微镜(日本 JEM-1011)，酶标仪(美国 BioTek EL-x800)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、全蛋白抽提试剂盒、WB封闭液、ECL检测试剂盒、Caspase 3、Caspase 9抗体均由上海蓝基生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养将D341细胞株接种于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、5% CO2、湿润空气的恒温培养箱中培养。

1.2.2细胞分组将体外成功培养的D341细胞，其中24 h组初始培养的细胞数1×106cells/ml， 48 h组初始培养的细胞数5×105cells/ml，72 h组初始培养的细胞数1×105cells/ml。按苦参碱浓度，分为实验组和对照组。在实验组中苦参碱浓度分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml和2.0 mg/ml，对照组中不加苦参碱。

1.2.3细胞形态学观察采用日本Nikon倒置相差显微镜对实验组、对照组的培养皿中的瘤细胞在药物作用24 h、48 h、72 h的生长情况，细胞形态进行观察。

1.2.4细胞超微结构观察实验组中苦参碱浓度为2.0 mg/ml，将实验组、对照组中的瘤细胞，在24、48、72 h后分别离心(1 000 r/min×5 min)，收集、洗涤、固定、脱水、包埋、切片，电镜观察。

1.2.5CCK-8法检测苦参碱对D341细胞增殖的影响取96孔细胞培养板，加入苦参碱浓度分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml和2.0 mg/ml，对照组不加苦参碱。每孔分别加入100 μl体外成功培养的细胞，根据作用时间不同所取初始细胞培养的个数同1.2.2，继续培养24、48、72 h，最终形成含5×107cells/ml细胞的悬液；取10 μl CCK-8分别加入各孔中，再培养3 h，混匀10 min，波长450 nm，以酶标仪测定各孔的吸光度，试验重复3次，计算抑制率。

1.2.6Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡按组别在六孔培养板各孔中分别加入含苦参碱的浓度同1.2.5培养基，再继续培养24、48、72 h后，洗涤、离心(2 000 r/min，5 min)、收集细胞，加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl Propidium Iodide摇匀，避光、室温下反应5～15 min，流式细胞仪检测。

1.2.7Western blot检测瘤细胞Caspase 3、Caspase 9蛋白的表达取24孔培养板，每孔分别加入含苦参碱的浓度同1.2.5培养基，再培养24 h、48 h、72 h，分别收集细胞，冰上裂解30 min，提取蛋白，以BCA法进行蛋白浓度的定量测定。常规制胶、上样、蛋白电泳、转膜、封闭。Ⅰ抗：Caspase 3 (1∶1 000)、Caspase 9 (1∶500)、β-actin(鼠抗1∶1 000)，4℃孵育过夜。洗膜 3次, 每次10 min。将膜与HRP结合的Ⅱ抗(辣根过氧化酶标记羊抗兔)(1∶5 000) 室温下摇荡孵育2 h，再充分洗膜、漂洗3次，每次10 min。显色、曝光、显影、定影、光密度扫描，以β-actin作内参照。

1.3统计学分析

2　结果

2.1形态学观察

在相差显微镜下观察活细胞生长情况。对照组细胞生长良好，胞体呈圆形、生长呈成簇性。在药物作用下，细胞生长较分散、稀疏状、细胞变形、破碎,甚至有坏死细胞出现。随着药物浓度增加(图1)，作用时间延长(图2)，这种现象更加明显。

Fig. 1D341 cell morphological observation by inverted phase contrast microscope with the effect of matrine(×100)

A: Control; B: 0.5 mg/ml; C: 1.0 mg/ml; D: 1.5 mg/ml; E: 2.0 mg/ml

Fig. 2D341 cell morphological observation by inverted phase contrast microscope with the effect of matrine(2.0 mg/ml) (×100)

A: 24 h; B: 48 h; C: 72 h

2.2超微结构的观察

对照组细胞膜完整、染色质分布均匀。实验组中苦参碱浓度为2.0 mg/ml，药物作用 24 h，细胞体积相对变小，有“气穴样空泡”结构出现。药物作用48 h，细胞核染色质浓缩明显，部分细胞核浓缩呈新月状附在核膜周围，细胞胞浆中可见“空泡”样结构数量增多，体积增大。药物作用 72 h，细胞核固缩明显，核裂解在部分细胞中可呈现，空泡明显增大(图3)。

Fig. 3D341 cell ultrastructure observation with transmission electron microscope (×50 000)

A: Control; B: 24 h; C: 48 h; D: 72 h

2.3苦参碱对D341细胞增殖的抑制作用

与对照组比较，药物浓度不同对细胞增殖的抑制程度不同，增殖抑制率随药物浓度的增加而逐渐升高，不同浓度的抑制率有统计学差别(P<0.01)。药物作用时间不同对细胞增殖的抑制程度不同，24 h与72 h组的抑制率有统计学差别(P<0.01)，但48 h与72 h、24 h与48 h组抑制率的差别却无统计学意义(表1)。

2.4苦参碱对D341细胞的凋亡作用

瘤细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而逐渐升高，随着作用时间延长而升高。其中0.5 mg/ml与1.0 mg/ml、1.5 mg/ml 与2.0 mg/ml组间凋亡率的差别无统计学意义，但是0.5 mg/ml、1.0 mg/ml与1.5 mg/ml、2.0 mg/ml组间的差别均有统计学意义(P<0.05)。24 h与48 h组间的差别无统计学意义，但24 h与72 h、48 h与72 h组间的差别有统计学意义(P<0.05， 表2)。

Tab. 1Inhibition effect of matrine on D341 cell

GroupInhibitioneffect(%)24h48h72hControl0000.5mg/ml10.50±1.81**11.60±2.06**12.70±1.71**○○1.0mg/ml21.30±2.11**##27.60±2.24**##28.30±2.85**##○○1.5mg/ml31.60±2.36**△△37.00±2.24**△△47.50±2.05**△△○○2.0mg/ml38.00±2.26**▲▲47.20±2.51**▲▲59.30±2.21**▲▲○○

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vs0.5 mg/ml group;?△△P<0.01vs1.0 mg/ml group;?▲▲P<0.01vs1.5 mg/ml group;?○○P<0.01vs24 h group

Tab. 2Effect of matrine on D341 cell apoptosis

GroupApoptosis(%)24h48h72hControl3.31±0.065.09±0.085.74±0.090.5mg/mL23.03±0.1024.20±0.0925.33±0.08△▲1.0mg/mL27.38±0.1031.24±0.0738.33±0.08△▲1.5mg/mL31.91±0.07*#38.22±0.09*#48.30±0.08*#△▲2.0mg/mL36.88±0.08*#44.90±0.07*#56.10±0.09*#△▲

*P<0.05vs0.5 mg/ml group;?#P<0.05vs1.0 mg/ml group;?△P<0.05vs24 h group;?▲P<0.05vs48 h group

2.5Caspase 3、Caspase 9蛋白表达水平的变化

Caspase 3、Caspase 9的蛋白表达水平随着苦参碱浓度的增加，表达逐渐增强(P<0.01，表3)。

Tab. 3　Caspase 3 and Caspase 9 expression of D341 cells observed by Western blott

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vs0.5 mg/ml group;?△△P<0.01vs1.0 mg/ml group;?▲▲P<0.01vs1.5 mg/ml group

3　讨论

中药广泛的抗肿瘤活性已被人们越来越多的认识。本文研究的苦参碱是苦参等豆科槐属植物中生物碱的有效成分，具有抗肿瘤效应，但其对人髓母细胞瘤细胞的作用少有报道。人们对中药的抗肿瘤机制主要集中在药物抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡及相关蛋白表达的变化[3]。

髓母细胞瘤的不良预后[4]，也是学者不断研究此肿瘤细胞生物学行为的动力。本研究以人髓母细胞瘤细胞系为靶细胞，观察苦参碱在体外对该细胞的诱导作用。苦参碱在体外对人髓母细胞瘤细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用。药物浓度不同对细胞增殖的抑制程度不同，增殖抑制率随药物浓度的增加而逐渐升高，不同浓度的抑制率有统计学差别。瘤细胞的凋亡率随着药物浓度的增加而逐渐升高，随着作用时间延长而升高。我们用光镜观察了在药物作用下细胞形态学改变，用透射电镜观察了在药物作用下细胞超微结构的改变。在药物作用下，细胞生长变得稀疏、分散、细胞变形、破碎,甚至有坏死细胞出现。随着药物浓度增加，作用时间延长，这种现象更加明显，而无药物作用组细胞却生长良好。而透射电镜也见证了细胞凋亡过程的发生：药物作用下瘤细胞出现“气穴样”空泡结构，细胞染色质浓缩、边缘化，作用时间越长，细胞核固缩越明显，部分细胞可见核裂解，空泡明显增大。

细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中起着重要作用，不同的凋亡途径最终都需激活的Caspase参与，Caspase主要通过与IAPs 结合导致活性丧失而抑制细胞凋亡[5]。Caspases家族是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，能特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，从而使它们具有能够高度选择性地切割某些蛋白质功能，一直被认为是细胞凋亡中心的执行者，现已确定至少存在11种Caspase，而Caspase 9被认为是细胞凋亡的起始者，Caspase 3被认为是细胞凋亡下游的关键执行者，两者之间存在着上下游关系，即起始者活化执行者[6]。研究发现[7，8]：Caspase 3处于细胞凋亡信号通路下游，经过经典的细胞内外凋亡途径促使线粒体释放细胞色素C，其可直接作用于Caspase 3、促使下游的Caspase 3等被激活降解底物使细胞凋亡。

本研究发现，苦参碱药物作用于D341细胞，随着苦参碱浓度的增加，细胞Caspase 3、Caspase 9的表达逐渐增强。也就是说，苦参碱对D341细胞的凋亡作用存在着一定的剂量依赖性，药物浓度增加，其凋亡作用也逐渐增强，这与文献表达是一致的。Yan F等[9]曾对大鼠骨肉瘤UMR-108细胞进行研究，认为：苦参碱抑制大鼠骨肉瘤UMR-108的生长，诱导线粒体Caspase依赖的凋亡途径，使用苦参碱后瘤细胞Caspase 3、Caspase 9蛋白的表达明显上调。Tan C等[10]研究认为：苦参碱对人类非小细胞癌的作用主要是通过Caspase起作用的凋亡途径，并呈剂量的依赖性。Dai ZJ等[11]则认为：苦参碱能抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和在体外诱导凋亡作用，其主要是通过激活Caspase 3的表达。

因此，深入研究苦参碱对人髓母细胞瘤细胞凋亡作用及其调节机制，为中成药物治疗人髓母细胞瘤的治疗领域具有广泛且深远的临床意义和应用前景。

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Effect of matrine on cell apoptosis and proliferation and the apoptosis related proteins of human medulloblastoma D341cells in vitro

ZHOU Kai-yu△, JI Hai-long, SHI Peng-fei

(Department of Neurosurgery, The First Clinical Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

Objective: To investigate the apoptosis and proliferation effect of matrine on human medulloblastoma cell line D341 in vitro and the effect of the expression of the related caspase 3 and caspase 9 proteins. Methods: The D341 cells were cultivated successfully in vitro.Then the cells were divided into 5 groups according to the concentration of matrine(0.5 mg/ml group, 1.0 mg/ml group, 1.5 mg/ml group, 2.0 mg/ml group and the control group was 0 mg/ml). All the experiments were repeated three times. The cell morphologic and structure change was observed with the optical microscope and the transmission electron microscope. The proliferation of D341 cell was analyzed using Cell Counting Kit-8 assay. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining. The expression of Caspase3 and Caspase9 was detected by Western blot． Results: With the effect of matrine, the proliferation inhibition rate gradually increased with drug concentrations increasing, and there was a significant difference (P<0.01). The inhibitory effect of matrine on cell proliferation was different with the different treatment time, there was a significant difference between the 24 h to 72 h groups (P<0.01). The apoptotic rate increased with matrine concentrations increasing. There were significant differences between the group of 0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml to the group of 1.5 mg/ml or 2.0 mg/ml (P<0.05). The apoptotic rate increased with the prolonged treatment time. There were significant differences between the group of 24 h or 48 h to the group of 72 h (P<0.05). With the increase of matrine concentration,the expression of Caspase 3 and Caspase 9 increased (P<0.01). Conclusion: Matrine induces the apoptosis, and inhibits the proliferation of human medulloblastoma D341 cells in vitro by up-regulation of the expression level of Caspase3, Caspase9.

matrine;human medulloblastoma D341cell;apoptosis;proliferation;Caspase 3;Caspase 9

浙江省中医药管理局科技计划资助项目(2013ZA133、2015ZB133)

2015-05-05

2015-07-09

△Tel：13957680507; E-mail：kerry2000year@163.com

R338

A

1000-6834(2016)01-074-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.019