Calbindin和Parvalbumin在C57BL/6J kit基因突变小鼠听觉传导通路中的表达*

张　峰， 沈　礼， 梁国庆， 孙　霞△

(1. 杭州师范大学医学院基础医学系， 2. 生命与环境科学学院， 浙江杭州310012)



Calbindin和Parvalbumin在C57BL/6J kit基因突变小鼠听觉传导通路中的表达*

张峰1， 沈礼1， 梁国庆2， 孙霞1△

(1. 杭州师范大学医学院基础医学系， 2. 生命与环境科学学院， 浙江杭州310012)

目的：观察钙结合蛋白(CB)和小清蛋白(PV)在C57BL/ 6J野生型小鼠与kit基因突变型小鼠(kit+/kitW-2Bao)听觉传导通路上的表达。方法：取kit突变型小鼠和野生型小鼠各6只，水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏灌流固定，取大脑进行冠状位冰冻切片。经免疫组织化学染色，观察CB和PV两种蛋白在小鼠听觉传导通路上的表达差异。结果：PV在野生型小鼠的腹侧耳蜗前核(AVCN)、腹侧耳蜗后核(PVCN)、下丘(IC)以及听皮层(AC)均有明显表达。CB在野生型小鼠的PVCN和斜方体核(Tz)有明显表达，在AC仅在2～3层有极少量表达。kit基因突变引起PV在PVCN、IC和AC的表达减少(P<0.01)，而Tz的表达增加(P<0.01)。CB在基因突变小鼠PVCN表达消失，AC的表达增加(P<0.01)。结论：PV和CB在野生型和突变型小鼠的听觉传导通路的表达存在明显差异。kit基因突变可引起PVCN、IC、Tz和皮层的PV表达变化，PVCN、AC的CB表达变化，表明kit基因突变对听觉通路高级中枢功能活动有一定的影响。

小鼠；kit基因；Calbindin；Parvalbumin

kit是一个与发育相关的基因，其编码的蛋白质是位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，功能十分复杂，控制着黑色素细胞、血细胞、原始生殖细胞、听毛细胞、肥大细胞以及小肠Cajal细胞等的发育[1]。研究资料表明，kit 基因突变可以影响内耳血管纹中黑色素细胞的功能，导致内淋巴电位消失，进而影响听毛细胞的感音功能[2,3]。但对于kit基因突变是否也能够影响高级听觉中枢的功能，目前尚未见报道。

钙结合蛋白(Calbindin, CB)和小清蛋白(Parvalbumin, PV)是细胞内对钙离子具有高度选择性结合位点的钙结合蛋白。CB和PV广泛分布在中枢神经系统内，主要参与细胞内钙离子浓度的调节，对细胞内钙的转运、缓冲有重要作用[4]。在哺乳类动物的脑里，CB和PV表达在具有互补功能的不同脑区，提示其表达和钙依赖的调节活动有关[5]。如在听觉系统中，研究发现CB和PV是互补表达在丘脑的不同区域。PV 主要分布在丘系即内侧膝状体的腹侧部，CB 则主要分布在非丘系即内侧膝状体背侧部和内侧部[5]。考虑到CB 和PV在听觉系统的不同表达以及其所代表的功能差异，本实验拟采用kit基因W-2Bao突变系小鼠[6,7]，通过免疫组化方法观察kit基因突变小鼠听觉传导通路中CB和PV两种蛋白表达上的变化来研究此影响。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂

C57BL/6J(B6)成年野生型小鼠，kit基因突变型成年小鼠(kit+/kitW-2Bao)，由杭州师范大学实验动物中心提供,体重20～30 g，雌雄不拘。Calbindin(小鼠单克隆抗体ab82812)，Parvalbumin(兔多克隆抗体ab11427),购自Abcam公司。相应二抗试剂和DAB染色试剂盒均购自博士德生物技术有限公司。

1.2免疫组织化学染色

实验动物用5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用0.9%的生理盐水经心脏灌流排血，后用4℃ 4%的多聚甲醛灌流固定，灌流结束后将大脑从颅骨中取出。将取出的大脑浸泡在4%的多聚甲醛溶液中后固定4 h。随后浸泡在30%蔗糖溶液中1～2 d，直至脑组织沉在溶液中。将浸糖后的脑组织修块后，用冰冻切片机做冠状位切片，切片厚度为40 μm，每只小鼠取三套切片，一套染CB，一套染PV，一套留下备用。

将切片用PBS液清洗三次，每次5 min。以1∶200稀释度孵育CB，1∶2 000的稀释度孵育PV，室温下过夜。随后，PBS液清洗三次，每次5 min。CB组加生物素化羊抗兔IgG， PV组加抗鼠IgG，室温下震荡孵育2 h。2 h后用PBS液清洗三次，每次5 min。用DAB试剂盒进行染色，将切片按顺序贴在赖氨酸处理过的载玻片上。待切片干燥后脱水脱脂封片[8]。

1.3结果判断

细胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞,每只小鼠相应核团随机取3张切片,在10倍目镜下计数核团内一个视野的CB和PV免疫反应阳性神经元的数量，取其平均数[9]。

1.4统计学分析

2　结果

2.1PV与CB在野生型小鼠和kit基因突变小鼠耳蜗核(cochlear nucleus, CN)中的表达PV在野生型小鼠的腹侧耳蜗前核(ventral cochlear nucleus, anterior part, AVCN)和腹侧耳蜗后核(ventral cochlear nucleus, posterior part, PVCN)均有表达，而在kit基因突变小鼠，在AVCN依然有PV表达，而在PVCN，表达明显减少，只在顶部有少量表达(P<0.01)。CB在野生型小鼠的PVCN阳性表达为72.5±19.71，AVCN几乎不表达或仅有极少量的表达。在kit基因突变小鼠，CB在PVCN细胞的阳性表达几乎消失(P<0.01)，在AVCN仍旧无表达(图1，表1)。

Fig. 1Expression of CB and PV in the CN of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar=100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice； B: Expression of PV in kit gene mutant mice； C: Expression of CB in wild type mice； D: Expression of CB in kit gene mutant mice； AVCN: Ventral cochlear nucleus, anterior part; PVCN: Ventral cochlear nucleus, posterior part

GroupCBPVAVCNPVCNAVCNPVCNWildtype2.34±2.4872.5±19.71148.3±40.3136±31.81Kitgenemutated4.21±2.812.66±2.5**151.8±35.4326.5±8.87**

CB: Calbindin; PV: Parvalbumin; AVCN: Ventral cochlear nucleus, anterior part; PVCN: Ventral cochlear nucleus, posterior part

**P<0.01vswild type mice

2.2野生型小鼠和kit基因突变小鼠下丘IC中，PV与CB的表达

在野生型小鼠的IC区域，PV有明显的表达，在kit基因突变小鼠， PV阳性细胞在IC的表达，出现明显减少的结果(P<0.01)。在野生型小鼠和kit基因突变小鼠的IC均检测不到CB阳性细胞(图2，表2)。

Fig. 2Expression of CB and PV in the IC of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar = 100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutated mice; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin; IC: Inferior colliculus

2.3CB与PV在野生型和kit基因突变小鼠Tz的表达

PV在野生型小鼠Tz表达为6.67±4.68，而kit基因突变小鼠的表达明显增加(P<0.01)。CB在野生型和kit基因突变小鼠的Tz表达没有变化 (图3，表2)。

Fig. 3Expression of CB and PV in the Tz of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar = 100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutant mice; Tz: Trapezoid body; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

2.4CB与PV在野生型小鼠和kit基因突变小鼠皮层中的表达

在野生型小鼠，PV 主要表达在听觉皮层的3～6层，在2层仅有少量的PV阳性细胞。在kit基因突变小鼠，PV在听皮层的表达和野生型小鼠相比明显减少(P<0.01)且主要集中在3～4层。 CB在野生型小鼠听皮层的表达主要分布在2～3层。kit基因突变引起CB在皮层的阳性细胞表达数量增加，且增加的阳性细胞分布的区域主要在3～5层(P<0.01,图4，表2)。

Fig. 4Expression of CB and PV in the auditory cortex of wild type and kit gene mutant mice(Scale bar=100 μm)

A: Expression of PV in wild type mice; B: Expression of PV in kit gene mutant mice; C: Expression of CB in wild type mice; D: Expression of CB in kit gene mutant mice; Au: Auditory cortex; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

3　讨论

kit是一种原癌基因，其编码的蛋白质是位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，其配体是干细胞生长因子(stem cell factor，SCF)。kit蛋白功能的突变会导致各种不同种类、不同程度的发育异常。在人类及小鼠，kit基因突变可以影响红细胞、生殖细胞及内耳的正常发育,并导致遗传性的“花斑马”白化病[1,2]。本研究所用突变小鼠kit+/kitW-2Bao的突变位点位于kit基因ORF第1229位，由G转换成T，此变化导致kit蛋白第410位的氨基酸由V→F，引起突变局部由β折叠转变成α卷曲。从kit蛋白的结构来看,位于膜外第5个免疫球蛋白样结构域。研究发现此类突变可以影响内耳的发育，从而影响听觉功能[6,7,10]。

Ca2+是重要的细胞内信号分子，参与神经细胞的多种功能活动，其功能的发挥需要钙结合蛋白CB和PV的共同参与。在中枢神经系统，PV主要表达在氨基丁酸能中间神经元中，在大脑皮层主要是枝形吊灯状和蓝状细胞[11]。已有的研究结果表明，在大鼠、小鼠、兔子、猫和猴子的听觉传导通路，CB和PV有不同的表达模式，PV主要在听觉的“核心”系统表达而CB在周围表达[5,12]。在本研究中，野生型小鼠PV和CB的表达也具备同样的模式。在野生型小鼠听觉传导通路中，PV在耳蜗核的AVCN、PVCN均有明显表达，在下丘IC有表达，在听觉皮层，PV在听皮层的表达主要在3～6层。CB仅仅在耳蜗核PVCN的顶端和腹侧有少量表达。CB在皮层的表达较PV少，且主要分布在皮层的2～3层。

Tab.

Cort: Cortex; IC: Inferior colliculus; Tz: Trapezoid body; CB: Calbindin; PV: Parvalbumin

**P<0.01vswild type mic

研究资料表明，kit 基因突变可以影响内耳血管纹中黑色素细胞的功能，导致内淋巴电位消失，进而影响听毛细胞的感音功能[2,3]。本实验结果表明，kit基因突变可以减少PV和CB在PVCN的表达，减少PV在IC的表达，但可增加PV在Tz的表达。与PV在CN的表达相比，CB在野生型小鼠的PVCN有少量表达，kit基因突变也可减少CB在PVCN的表达。表明在脑干水平kit基因突变可引起PV和CB的表达变化。

研究已知，来自内侧膝状体腹侧核(ventral part of medial geniculate body, MGv)的投射纤维终止在听皮层的3/4层，听皮层的第5和6层细胞发出下行投射分别到IC和MGv。在小鼠的听觉皮层大多数PV表达阳性的细胞属于抑制性的中间神经元,但也有少量的锥体细胞表达。PV在皮层和内侧膝状体的阳性表达区域也反应了其在结构上的一致性，即主要和皮层下的听觉结构相关。CB表达阳性的细胞主要在2、3层，主要是皮层内的相互投射以及投射到对侧的皮层[13]。研究发现在皮层发育的晚期，PV阳性和CB阳性的神经元分布依然会发生改变，提示神经网络的形成与后期经验依赖的可塑性发展有关[13]。本实验中kit基因突变引起的PV和CB表达的改变，表明kit基因突变对听觉通路高级中枢的神经网络的形成有一定的影响。本实验发现PV和CB在kit基因突变小鼠中的表达模式，有助于了解kit基因在听觉通路的作用机制。本文提出kit基因可能影响听觉中枢的功能，有助于对相关疾病机制的了解。

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The expression of Calbindin and Parvalbumin in auditory pathway of kit gene mutated C57BL/6J mouse

ZHANG Feng1, SHEN Li1, LIANG Guo-qing2, SUN Xia1△

(1. Hangzhou Normal University School of Medicine， 2. College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University, Hangzhou 310012, China)

Objective: To observe the expressions of Calbindin(CB) and Parvalbumin(PV), the two calcium-binding protein, in auditory pathway in mice of wild type C57BL/ 6J and kit+/kitW-2Bao, a kit gene mutant. Methods: Six mutated kit gene kit+/kitW-2Bao mice and 6 wild type C57BL/6J (B6)mice were anaesthetized i.p. with chloral hydrate. After the mice were fixed by heart perfusion, the brains were removed and coronal sections were cut with a freezing microtome. Results: We found that wild type mice had significant expressions of PV on ventral cochlear nucleus, anterior part (AVCN), ventral cochlear nucleus, posterior part (PVCN), inferior colliculus (IC) and auditory cortex (AC). CB was expressed in wild type mice on PVCN and nucleus of the trapezoid body (Tz). The mutant of kit gene induced the less expression of PV on PVCN, IC and AC (P<0.01)，but increased the expression of Tz (P<0.01). CB could not be observed on PVCN in mutant mice, and the expression of AC was increased(P<0.01). Conclusion: CB and PV has differential expression level in auditory pathway. Since mutated kit gene can affect expression of PV on PVCN, IC, Tz and AC, as well as CB on PVCN and AC, it suggests that the mutation of kit gene can affect the advanced function of central nervous system in auditory pathway.

mouse；kit gene；Calbindin；Parvalbumin

国家自然科学基金资助项目(31171060)；杭州市科技计划项目(20100333T07)

2015-02-25

2015-10-16

△Tel：13094813900； E-mail：sunxiasun@gmail.com

Q189

A

1000-6834(2016)01-022-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.006