骶神经电刺激对重建脊髓损伤后大鼠结肠功能的作用及其机制*

白春宏， 马信龙

(天津医科大学骨科临床学院， 天津医院， 天津 300211)



骶神经电刺激对重建脊髓损伤后大鼠结肠功能的作用及其机制*

白春宏， 马信龙△

(天津医科大学骨科临床学院， 天津医院， 天津 300211)

目的：探讨骶神经电刺激对脊髓损伤大鼠结肠功能的作用及机理。方法：104只 Wistar 大鼠分A、B、C三组:A组24只分为正常组(NG)、急性完全性脊髓损伤组(SCI)和骶神经电刺激组(SNS)，每组8只测量结肠电生理。B组24只分为NG、SCI和SNS(n=8)，测量结肠动力。C组56只大鼠分为NG(n=8)、SCI(n=24)和SNS(n=24)，SCI和SNS组按照处理后24、48、72 h再分为3亚组(n=8)。观察肠道形态改变及P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)的改变。结果：SCI组结肠电生理活动减少、动力降低、肠黏膜不同程度损伤、肠道上皮细胞及细胞间连接破坏、SP和VIP含量均降低。SNS组电生理开始活跃，结肠动力提升，肠黏膜得到改善，SP和VIP含量均明显提高。结论: 骶神经电刺激可通过提高结肠生物电及神经递质来促进结肠蠕动、恢复动力、保护肠黏膜上皮细胞及紧密连接的机械屏障，重建结肠功能。

脊髓损伤;电刺激;结肠功能；大鼠

急性完全性脊髓损伤( spinal cord injury，SCI)患者除了运动和感觉障碍，通常还有自主神经功能障碍，主要包括心血管、性、膀胱和肠道功能障碍[1]。结肠、 直肠功能障碍在损伤后可立即出现[2]。SCI后肠道功能障碍主要表现为便秘、大便失禁、自主反射失调、腹痛腹胀等，在严重的情况下，还将出现肠道细菌移位和内毒素血症。Bai 等[3]通过电刺激家兔的骶3神经根，发现刺激后家兔的肠道症状、菌群移位、内毒素血症等均得到改善；同时证实肠道功能障碍主要体现在结肠部分，中远段结肠几乎完全失去动力，大便梗阻。经骶神经电刺激后，结肠功能部分恢复，排便同时减少细菌移位和内毒素血症的发生。但迄今关于骶神经电刺激( sacral nerve stimulation，SNS)对SCI后结肠功能的恢复重建机理仍未被阐明。本实验旨在初步探讨SNS对SCI大鼠结肠功能恢复重建的作用机理，为其在临床上的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

仪器：RM6240c多道生物系统采集器(成都仪器厂，中国)，氯化银银丝记录电极(成都仪器厂，中国)，体视显微镜(Olympus，日本)，荧光分光光度计(HTS-7000 Plus-plate-reader，美国)，低温离心机(Sigma，美国)试剂：PBS(Sigma，美国)，dextran-4000-FITC(Sigma，美国)，葡聚糖蓝-2000(Sigma，美国)，甲醛(Sigma，美国)。

1.2实验动物与分组

Wistar大鼠104只，体重250～300 g(北京维通利华公司)，雌雄不拘。104只 Wistar 大鼠分A、B、C三组:A组24只：分为正常组(NG)、急性完全性脊髓损伤(SCI)组和骶神经电刺激组(SNS)(n=8)，测量结肠电生理。B组24只分为NG、SCI和SNS(n=8)，测量结肠动力。C组56只大鼠分为NG(n=8)、SCI(n=24)和SNS(n=24)，SCI和SNS组按照处理后24、48、72 h再分为3亚组(n=8)。观察肠道形态改变及SP、VIP的改变。SNS应用前期实验得出的刺激参数为：电压4 V,波宽 0.21 ms，频率 15 Hz，刺激时间 10 s，间歇时间20 s，每次刺激 10 min，休息 10 min，共持续 2 h。每天8∶00～10∶00，18∶00～20∶00刺激两次。实验过程中如有死亡，采用同标准的大鼠用同样的办法补充。实验前置(22～25)℃室温，饲养1 周，普通饲料喂养，使其适应。

1.3肠道生物电活动测量

动物麻醉后置于仰卧位，局部消毒，沿腹部中线暴露结肠。分别于近端结肠、远端结肠浆膜层切开2 mm切口，置于氯化银包绕的银丝记录电极后缝合。近段结肠置入位置距离回盲部2～3 cm，远端结肠距离肛门5～6 cm。手术过程中未损伤肠道的血管袢，手术后恢复腹腔内脏器位置，缝合伤口。导线置于皮下，由后背引出。手术后待动物恢复7 d后再进行下步实验。

1.4脊髓损伤截瘫模型建立及神经根刺激电极置入

动物麻醉后置于俯卧位，定位T6棘突，脱毛剂脱毛，局部消毒。手术暴露脊髓，用神经剥离器轻轻挑起后，采用Fehlings法，用98 g动脉瘤夹横行钳夹约1 min，见双下肢抽搐停止。去除动脉瘤血管夹，冲洗伤口后缝合，无菌包扎。定位骶3神经孔，脱毛剂脱毛后，局部消毒，暴露左侧骶3神经孔，置入双极电极，根据刺激时尾部肌肉是否收缩确定电极位置，冲洗伤口后缝合，导线置于皮下，由后背引出，无菌包扎。

1.5肠道动力测量

大鼠回盲部的近端结肠内注入葡聚糖蓝-2000 0.4 ml,1.5 h后大鼠颈椎脱臼处死,立刻取出全部结肠测量结肠中葡聚糖蓝-2000推进距离及结肠全长计算结肠推进率(葡聚糖蓝-2000推进距离/结肠全长×100%)。

1.6组织学观察

取结肠，用4%甲醛液固定，经梯度乙醇系列脱水、二甲苯透明后，常规石蜡包埋、HE染色、光学显微镜观察记录。

1.7扫描电镜

动物处死后立即取材，用10 g/L戊巴比妥钠按50 mg/kg腹腔注入麻醉大鼠,取出小肠用0.1 mol/L的PBS溶液冲洗,切成1 cm× 1 cm大小的组织片, 加入30 ml/L戊二醛固定液进行前固定,4℃冰箱内2 h以上;0.1 mol/L PBS漂洗10 min×3次;用500、750、1 000 ml/L乙腈梯度脱水30 min× 1次;JEE-4X真空蒸发仪真空干燥,JFC-l100离子溅射仪喷金处理;扫描电镜下观察。

1.8免疫组化检测

常规脱蜡和水化; 3% H2O2滴加在石蜡切片组织上，室温静置 10 min，PBS 洗5 min×3次; 抗原修复: 将 0．01 mol/L 枸橼酸钠缓冲液(pH 6．0) 放置于微波炉里加热至沸腾后将石蜡切片放入，断电，间隔 5～10 min，反复1～2次，冷却至室温，PBS 洗5 min×3 次; 滴加 5% BSA 封闭液，放入湿盒后，将湿盒置于 37℃恒温箱中 20 min; 甩去 5% BSA 封闭液滴加Ι抗 50 μl，4℃ 过夜; 4℃ 过夜后，放置于37℃ 恒温箱中复温 45 min，PBS 洗 5 min×3 次; 滴加Ⅱ抗 45～50 μl，放置于37℃恒温箱中1 h，PBS洗 5 min×3 次; DAB 显色 5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，PBS 或自来水冲洗 10 min; 苏木精复染 2 min，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗 10～15 min; 脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化图像分析：计算机图像处理系统由CMOS(日本OLYMPUS公司)及专用软件(美国MediaCybernetics公司Image-ProPlus)组成。依据阳性免疫反应的图像灰度选择合适的灰度分割阈值，实现双阈值分割，得到样品的灰度目标图像，以人机交互方式测定。每例测5个视野，由计算机计算出所测阳性反应物平均光密度。经统计学t检验各组之间相对含量是否存在差异。

1.9统计处理

应用 SPSS 13.0 统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。

2　结果

2.1结肠生物电检测

与NG组相比，SCI组近端结肠、远端结肠生物电峰值降低，差异有显著性意义(P<0.01)。与SCI组相比，SNS组近端结肠、远端结肠生物电峰值明显升高，差异有显著性意义(P<0.01图1、图2，表1)。

Fig. 1Proximal colon myoelectric activity in every group

a：NG; b：SCI； c：SNS； NG: Normal group; SCI: Spinal cord injury group; SNS: Sacral nerve root electrostimulation group

Fig. 2Distal colon myoelectric activity in every group

a：NG; b：SCI； c：SNS； NG: Normal group; SCI: Spinal cord injury group; SNS: Sacral nerve root electrostimulation group

Group PCDC NG133.0±22.158.3±16.4SCI45.0±11.4**17.8±4.0**SNS109.2±8.8**##42.1±10.3**##

PC: Proximal colon; DC: Distal colon; NG: Normal group; SCI: Spinal cord injury group; SNS: Sacral nerve root electrostimulation group

**P<0.01vsN;?##P<0.01vsSCI

2.2肠道动力测量

推进长度(cm): N (8.5±0.5)cm与SCI(4.0±0.3)cm差异具有统计学意义(P<0.01)，SNS(7.4±0.5)cm与N、SCI差异具有统计学意义(P<0.01)。

肠推进百分率(%): N (80.6±2.6)与SCI(37.9±3.5)差异具有统计学意义(P<0.01)，SNS(70.3±4.4)与N、SCI差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3组织学观察结果

HE：NG未见明显异常变化，SCI组结肠：光镜下对照组黏膜下水肿、淤血，大量炎性细胞浸润，肠绒毛破坏，上皮细胞坏死，大量渗出，肠绒毛高度下降，数量减少；SNS组黏膜下血管轻微充血，少量炎性细胞浸润(图3，见彩图页Ⅰ)。

扫描电镜：N组结肠微绒毛排列整齐，无破损；SCI组结肠黏膜破坏严重，微绒毛脱落，局部破损明显，细胞裸露，机械屏障破坏；SNS组绒毛损伤明显减轻，轻微紊乱(图4)。

Fig. 4Every group intestine in scanning electron microscope(SEM)

a: NG(×500)； b: SCI 72 h group injured(×1 000)； c: SNS 72 h group improved(×1000)； NG: Normal group; SCI: Spinal cord injury group; SNS: Sacral nerve root electrostimulation group

2.4结肠SP、VIP表达

SP阳性反应细胞主要存在于肌间神经丛，以胞浆着色为主，棕黄色，细胞核为蓝色(图5，见彩图页Ⅰ)。半定量分析发现SCI组SP含量与NG相比差异有统计学意义(P<0.01)；SNS与SCI比较差异有统计学意义(P<0.01)；SNS与NG比较差异有统计学意义(P<0.05)。VIP阳性反应细胞主要存在于肌间神经丛，着色为棕褐色，细胞核为蓝色(图6，见彩图页Ⅰ)。半定量分析发现SCI组VIP含量与NG相比差异有统计学意义(P<0.01)；SNS与SCI比较差异有统计学意义(P<0.05)； SNS与NG比较差异无统计学意义(表2)。

GroupSPVIPNG125.4±9.3108.0±7.0SCI(72h)38.5±8.0**29.1±7.2**SNS(72h)111.5±7.8*##95.1±9.1#

NG: Normal group; SCI: Spinal cord injury group; SNS: Sacral nerve root electrostimulation group; SP: Substance P; VIP: Vasoactive intestinal peptide

*P<0.05，**P<0.01vsN;?#P<0.05，##P<0.01vsSCI

3　讨论

SCI后大多数患者出现长期的腹胀、腹痛及发热等表现，有的甚至出现急性全身炎症反应综合症、脓毒血症、败血症甚至感染性休克等严重并发症。随着通过SNS促进肠动力解决排便问题的发展，为重建脊髓损伤后的盆腔器官排泄功能，模拟正常肠道生理来恢复急性完全性脊髓损伤后肠道功能带来希望。SNS电刺激神经根能较好地促进肠道蠕动(结肠为主，但全肠道蠕动均有明显改变)，促进肠内容物的排出；进而减轻相关并发症[3]。因此研究SNS对结肠功能重建的机理极为必要。

SNS主要是通过模仿正常的神经冲动，刺激相应支配区域的神经的起博点，达到恢复效应器功能[4]。SNS促进肠道动力的作用机制尚未明确，这涉及到传入和局部反射通路的调节等多种生理效应[5-8]:调节改善直肠低敏感性病人的直肠感觉阈值,改善脊髓损伤病人的肠道压力和动力以及肛门壁和盆底肌肉的功能,引起可逆的神经冲动导致动态的脑皮质改变，进而影响肛门顺应性,调节肠道神经系统或者是相应脊髓平面的反射通路来完成的。大量临床回顾性研究已经证实SNS确实能够改善SCI患者的肠道动力，提高生活质量。Moya[9]等对11位SCI慢传输便秘患者植入永久性刺激，随访34月，发现排便次数从1次/周增加到4次/周，8位完全停止使用泻剂。那么，SNS是如何重建结肠的功能的呢？本研究从SNS对结肠的电生理、蠕动、形态改变及分子生物学几方面的改善情况进行观察，详细了解SNS对结肠功能重建的机理。本实验结果显示，SCI组大鼠结肠的生物电峰值较正常组显著降低，结肠动力减弱明显，肠黏膜绒毛破坏严重。SNS组的绒毛长度、数量，肠黏膜上皮细胞完整性较对照组均有不同程度改善。这与SNS能够改善肠道屏障功能障碍是相一致的。同时，SNS大鼠的结肠动力恢复也较明显。

肠道神经系统主要包括黏膜下神经丛和肌间神经丛两大类，前者分布在消化道黏膜下，其运动神经元主要释放乙酰胆碱和血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)；而肌间神经丛主要分布于纵行肌和环行肌之间，包括兴奋性神经元(递质为乙酰胆碱、P物质)和抑制性神经元(递质为VIP和NO)。肠神经系统主要起控制肠道运动和分泌活动，并调控内脏敏感性的作用。

SP作为神经递质，在肠道从近端小肠到全结肠肠神经系统肌间神经丛及黏膜下神经丛内均含有SP的神经、神经纤维。SP对肠蠕动有一定的影响[10],肠蠕动的头端收缩反射是有食团刺激了肌间丛中含降钙素基因相关肽神经元的张力感受器释放乙酰胆碱和SP而发挥作用。肠道神经系统含乙酰胆碱、SP、速激肽的兴奋性神经元轴突均朝向头端分布，构成肠蠕动反射中头端收缩的神经结构基础。SP可刺激平滑肌收缩，特别是对空肠、回肠和结肠的平滑肌。对鼠结肠压力升高是通过SP对全结肠肌的直接作用、对近端的非胆碱能刺激、对中及远端的胆碱能神经刺激、对依赖NO的抑制性神经系统的刺激作用实现的。消化间期移行性复合运动Ⅲ相血浆SP水平明显高于I、Ⅱ相。推测SP可能参与调节人消化间期MMC运动。VIP对肠蠕动有一定的调节作用。小肠蠕动反射是由于食团刺激肠壁上方的环行肌收缩及其下方的环形肌同时舒张。尾端舒张反射是肌间丛的VIP神经元释放VIP引起的肠舒张，VIP参与肠蠕动推进性复合波的下行性松弛。免疫组化技术证明，肠道神经系统含VIP、一氧化氮合成酶(NOS)的抑制性神经元轴突朝尾端分布，构成了肠蠕动反射中尾端舒张的神经结构基础。另外，VIP对胃肠平滑肌的活动也有调节作用。可减慢胃排空，参与结肠扩张和疼痛刺激引起的胃的反射性松弛。McNearney等[11]发现长时间经皮电刺激可改变VIP含量并调节肠道动力。我们发现：脊髓损伤后，结肠 SP、VIP明显减少，这与结肠的电生理减弱、动力减低相对应；SNS后，SP、VIP明显增多，SP增多促进肠道蠕动、增加结肠压力并调节人消化间期MMC运动；VIP明显增多促进尾端舒张反射， 调节结肠蠕动及内容物的排泄。对应的表现是结肠的电生理的活跃及肠动力恢复，同时，随着蠕动的加强和排泄的增强，肠粘膜的形态也得到恢复。

总之，SNS可以促进结肠电生理的活跃程度，增强神经递质SP、VIP的表达，因此促进结肠动力，调节肠道蠕动，加速排泄，进而改善肠粘膜的损伤情况，保护肠黏膜上皮细胞及紧密连接的机械屏障，从而达到重建结肠功能的效果。

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The effects of sacral nerve root electrostimulation on the colon function and its mechanisms in a rat model of spinal cord injury

BAI Chun-hong, MA Xin-long△

(Tianjin Hospital, The Clinical Orthopedics of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China)

Objective: To study the effects of sacral nerve root electrostimulation (SNS) on the colon function and its mechanisms in rats with spinal cord injury (SCI)．Methods: One hundred and four Wistar rats were divided into three groups: A,B and C. A group (n=24) was divided into three subgroups (n=8) for studying the bioelectricity: Normal group (NG), SCI group(SCI) and SCI group with SNS(SNS); B group(n=24) was divided into three subgroups(n=8) for studying the colon motility: NG, SCI and SNS. C group(n=56) were divided into three groups for studying the change of morphology and neurotransmitters(SP and VIP): NG(n=8), SCI(n=24), and SNS(n=24). In SCI and SNS, included of three subgroups:24, 48, 72 h after spinal cord injury(n=8)．Results: In SCI group, the activity of bioelectricity in proximal and distal colon was reduced; the colon motility was lessened, and colon mucosa appeared different degree of damage; cell-cell connections between intestinal epithelial cells were destroyed.The expressions of substance P(SP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) in colon were decreased obviously．SNS was found to activate the bioelectricity, promote the colon motility, improve the intestinal mucosal， and increase the expressions of SP and VIP．Conclusion: SNS can activate the peristalsis, rehabilitate the motility of denervated colon，protection of the intestinal mechanical barrier between intestinal epithelial cells and tight junction, rebuild the colon function through activating the bioelectricity and increase the expressions of SP and VIP．

spinal cord injury;electric stimulation;colon function; rats

国家自然科学基金青年项目(81101441)；天津市企业博士后创新项目择优资助(一等)

2015-05-25

2015-10-20

△Tel: 022-23197199; E-mail: mjx969@163.com

R454.1

A

1000-6834(2016)01-034-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.009