IL-17与TNF-α对HaCaT细胞IL-17R、p-p38 MAPK和炎症因子表达的影响

沈奎亚，刘梅，吴新安

(解放军第一〇五医院药剂科，安徽 合肥　230031)



IL-17与TNF-α对HaCaT细胞IL-17R、p-p38 MAPK和炎症因子表达的影响

沈奎亚，刘梅，吴新安

(解放军第一〇五医院药剂科，安徽 合肥230031)

摘要：目的考察IL-17与TNF-α共作用对皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞IL-17R、p-p38 MAPK表达的影响，及其对HaCaT细胞分泌IL-6、IL-8、MIP-3α等炎症因子的影响。方法采用RT-PCR方法检测IL-17与TNF-α共作用对皮肤角质形成细胞IL-17R mRNA表达的影响；采用western blot方法检测IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞表达p-p38 MAPK的影响；采用ELISA法检测IL-17与TNF-a共作用对HaCaT细胞分泌炎症因子IL-6、IL-8及MIP-3α的影响。结果IL-17与TNF-α共作用可上调HaCaT细胞表达IL-17R和p-p38 MAPK，以及上调HaCaT细胞IL-6、IL-8、MIP-3α等炎症因子的分泌。结论IL-17与TNF-α共作用可通过上调皮肤角质形成细胞IL-17R的表达，促进p38 MAPK的磷酸化过程而具有明显致炎作用。

关键词:白细胞介素17;肿瘤坏死因子α;AMP活化蛋白激酶类;趋化因子CCL20;白细胞介素6;白细胞介素8

角质形成细胞(Keratinocytes,KC)占表皮细胞80%以上，是由外胚层在分化的过程中形成具有保护作用的角蛋白，当受到侵袭时，其本身不仅具有皮肤屏障抵抗外界侵袭的能力，而且能启动固有免疫和激活获得性免疫，产生抗菌肽、β-防御素以及细胞和趋化因子，介导皮肤炎症的发生发展[1-2]。人永生化表皮细胞(HaCaT)株来源于人皮肤，培养时呈正常的上皮样细胞形态，贴壁生长，对培养条件要求不高，培养、传代、冷冻均较容易，与正常人角质形成细胞具有相似的分化特征，作为体外抗菌药研究的模型是一很好的选择。IL-17在保护宿主防御感染中起到关键作用，其可以与白介素-17受体(IL-17R)结合进行信号转导后发挥作用，也能够诱导介导防御反应的TNF-a、IL-1b、IL-6等促炎症因子参与到很多免疫性疾病及炎症发生与发展的过程中。TNF-α也是致炎因子之一，它可以通过死亡受体途径促进细胞的凋亡[3]；在强直性脊柱炎患者中高表达，是其发病过程中重要的致炎因子[4]，Meta分析也证实两者有一定的关联[5]；与冠心病也有一定的相关性[6]。据报道，IL-17与TNF-α有协同作用，但其机制尚不清楚。p38 MAPK信号分子对炎症因子和应急信息进行信号转导，从而参与调控炎症介质的基因表达过程。因此，本研究从IL-17与TNF-α二者间的相互作用着手，探讨IL-17与TNF-α共作用的可能作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂胰蛋白酶(AMRESCO)；小牛血清(四季清生物)；胎牛血清(GIBCO公司，Invitrogen Corporation)； RPMI1640培养基(GIBCO/BRL)；MTT(AMRESCO)；二甲基亚砜(中国医药集团)；青霉素(80万U，华北制药)；链霉素(1 g，华北制药)；新生牛血清(杭州四季青)；小鼠抗人IL-17R单克隆抗体(R&D systems)；小鼠抗人p38 MAPK单克隆抗体(R&D systems)；小鼠抗人p-p38 MAPK单克隆抗体(R&D systems)；HRP标记山羊抗小鼠IgG(南京金思特)；焦碳酸二乙酯(Bio Basic Inc.)；电泳琼脂糖(Bio Basic Inc.)；溴化乙锭(AMRESCO)；BCA蛋白测定试剂盒(PIERCE CO.)；Supersignal West Femto 显影试剂盒(PIERCE CO.)；苯甲磺酰氟(Calbiochem CO.)；四甲基乙二胺(上海华舜生物)；预染蛋白Marker(19-120KD，晶美公司)； UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒(上海生工生物)；RT-PCR试剂盒(宝生物工程)。

1.1.2仪器CO2培养箱(FORMA，美国)；PCR仪(Biometra，德国)；生物洁净工作台(SDJ-ZS型，上海)；生物电泳图像分析系统(FR-980型，上海复日科技)；高速台式离心机(TGL-168，上海安亭公司)；超低温冰箱(HARRIS公司，美国)；PCR分析软件(Roche diagnostics公司，美国)；超声振荡仪(DL-720型，浙江海天)；磁力搅拌器(79-2型，广东国华)；电泳仪(M-250型，上海百特科技)；微量移液器(NICHIRYO公司，日本)；数显式三用恒温水温箱(上海跃进)；脱色摇床(上海琪特仪器)；微型涡旋混合器(上海跃进)；垂直电泳系统(Mini-PROTEA，美国Bio-Rad公司)；转印系统(Mini Trans-Blot，美国Bio-Rad公司)；UVP Bioimaging Systems(美国UPLand公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR分析将培养接近融合状态的HaCaT细胞提取总RNA，按RT-PCR试剂盒方法首先逆转录合成cDNA，IL-17R的扩增片段长186 bp，其正义引物cactcactctacgcaaccttaa，反义引物agatgcccgtgatgaacc。内参GAPDH扩增片段长133 bp，其正义引物aacggatttggtcgtcgtattgg，反义引物gggtggaatcatattggaaca。PCR的反应条件为：变性(95 ℃，30 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃、1 min)，共计循环35次，最后与72℃延伸5 min。将PCR产物电泳，电泳后置电泳图像分析系统中进行处理分析。最后将产物分离纯化并测序，用BLAST程序比对分析测得序列与Genebank的已知序列。

1.2.2Western印迹分析将培养瓶中接近融合的HaCaT细胞抽去上清液，依次加入无血清的培养基、含IL-17(10 μg·L-1)的培养基、含TNF-α(10 μg·L-1)的培养基及含IL-17与TNF-α各10 μg·L-1的培养基继续培养24 h。在冰浴下用改良型RIPA细胞裂解液对细胞进行裂解0.5 h收集蛋白样品，为保证蛋白上样量浓度一致，用BCA蛋白浓度测定试剂盒总蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶，将蛋白样品与沸水浴加热5 min充分变性，冷却后上样并电泳。用PVDF膜转膜，电压设定为60 V,转膜1 h。封闭液封闭1 h后，分别加入各1 mL的一抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、GAPDH小鼠单克隆抗体(稀释比例为1∶500)，4℃孵育。次日再加入1 mL的二抗稀释比例为1∶1 000的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，孵育后洗膜，按显影试剂盒操作显影后置UVP成像系统中摄像，根据目的基因和内参基因的条带灰度值进行分析。

1.2.3ELISA测定将培养板上近融合的HaCaT细胞分别加入无血清的培养基、含IL-17(10 μg·L-1)培养基、含TNF-α(10 μg·L-1)的培养基、含IL-17和TNF-α各(10 μg·L-1)的培养基继续培养24 h。将上清液吸取后，在离心机上以1 000 r·min-1的速度离心5 min。以试剂盒的方法测定上清液中IL-6、IL-8、MIP-3α的含量。

2　结果

2.1IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞IL-17R mRNA表达的影响PCR产物的电泳图(图1)显示，IL-17R在HaCaT细胞上有明显表达，产物片段大小与设计一致，条带较清晰，未见杂带。较正常对照组相比，IL-17与TNF-α共作用刺激HaCaT细胞24 h后，IL-17R mRNA的表达量上调95.6%，较正常对照组相比，差异明显(P<0.01)。IL-17(10 μg·L-1)单独应用可使IL-17R mRNA的表达量上调51.2%，TNF-α(10 μg·L-1)单独应用可使IL-17R mRNA的表达量上调78.3%，两者均较正常对照组差异明显(P<0.01)。PCR产物经分离纯化，进行测序。测得序列用BLAST程序通过Internet与Genebank的已知序列进行比对分析，HaCaT细胞IL-17R的序列与已知人IL-17R序列的同源性达100%。

2.2IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞p-p38 MAPK表达的影响Western blot结果见图2。较空白对照组而言，各处理组对HaCaT细胞表达p38 MAPK的作用不明显，而对p-p38 MAPK有明显影响。据灰度值测定，IL-17与TNF-α共作用可使HaCaT细胞上p-p38 MAPK的表达量明显上升，分别较空白对照组、IL-17组、TNF-α组升高1.5、0.8、0.5倍，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：1:control;2:IL-17 10 μg·L-1;3:TNF-α 10 μg·L-1;4 IL-17 10 μg·L-1+ TNF-α 10 μg·L-1。

图1IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞表达

IL-17R mRNA的影响

注：1:control;2:IL-17 10 μg·L-1;3:TNF-α 10 μg·L-1;4:IL-17 10 μg·L-1+ TNF-α 10 μg·L-1。

图2不同刺激因素对HaCaT 细胞上p38和p-p38 MAPK表达的影响

2.3IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞IL-6、IL-8、MIP-3α等炎症因子分泌的影响IL-17与TNF-α共作用刺激HaCaT细胞24 h后，用ELISA试剂盒测定细胞上清液中IL-6、IL-8、MIP-3α的浓度，ELISA结果见表1。HaCaT细胞自身可分泌少量IL-6、IL-8、MIP-3α。以IL-17(10 μg·L-1)刺激HaCaT细胞24 h后，IL-17可显著增加HaCaT细胞IL-6、IL-8、MIP-3α的分泌量，分别为对照组的1.4倍、1.1倍和1.7倍。TNF-α可亦可升高IL-6、IL-8、MIP-3α的表达水平，其表达量明显高于对照组(P<0.01)。将IL-17(10 μg·L-1)与TNF-α(10 μg·L-1)共孵育，IL-6、IL-8、MIP-3α的表达量明显上调，较单用IL-17组分别升高530%、24.2%、70.1%，较单用TNF-α分别升高90.3%、10.0%、13.1%。

表1　IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞分泌 IL-6、IL-8、MIP-3α的影响

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与IL-17组比较，cP<0.01。

3　讨论

IL-17有六个家族成员，其中IL-17A、IL-17E及IL-17F是重要的促炎症因子，它具有可诱导中性粒细胞趋化、调控细胞因子的释放等广泛的生物学效应。IL-17可以促进中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等分泌炎症因子、趋化因子及黏附分子，如MMP3、G-CSF、IL-6、IL-8、ICAM-1等。IL-17可促进树突状细胞的分化成熟，并可诱导TNF-α、iNOS、LIF、MCP-1、MCP-2、PGE2等的释放，这些分子在炎症、免疫的不同阶段具有不同的功能。在缺血再灌注损伤、炎症性肠病、类风湿性关节炎中也起到一定作用[7-9]。

TNF-α是一种单核因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。不仅可以杀伤或抑制肿瘤细胞，还有抗感染以及提高中性粒细胞的吞噬能力。TNF-α有中性粒细胞和单核细胞趋化作用，从而释放炎症介质。本文考察了IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞IL-17R的影响，RT-PCR结果显示，IL-17、TNF-α均使IL-17R mRNA的表达量提高，IL-17与TNF-α共作用对HaCaT细胞上IL-17R的表达有明显的上调作用，表现为很强的协同作用。

p38 MAPK通过磷酸化作用在信号转导过程中激活许多炎症转录因子，调节细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等基因表达，还能激活细胞内的某些蛋白激酶，进一步磷酸化而参与细胞应激反应。p38途径对许多炎症介质的基因表达起调控作用，反过来炎症介质也能激活p38 MAPK进而作用于p38 MAPK下游底物，从而在形成一个逐级放大的炎症反应过程。p38激活的过程为：炎症刺激信号通过多级磷酸化反应激活MEK3/6，MEK3/6使p38 MAPK特定的Thr-Gly-Tyr基序中的Thr和Tyr磷酸化，进而激活p38 MAPK的下游分子，如ATF2、NF-κB等。皮肤炎症变化过程中，浸润的炎症细胞及皮肤组织细胞之间可能存在着广泛的信号联系。Western blot结果显示，IL-17能提高p-p38 MAPK的表达，而IL-17与TNF-α共作用可协同升高p-p38 MAPK的表达。

IL-6是一种具有多种生物学效应的细胞因子，是重要的致炎因子之一，能调节和介导其他细胞因子的表达。在全身炎症反应综合征中因诱导急性期蛋白合成与分泌而发挥重要作用[10]。IL-8是一种能吸引白细胞到达感染部位的趋化因子，在炎症反应中扮演着重要角色，有促进中性粒细胞的游走和趋化作用。CCL20基因编码的MIP-3α(人巨噬细胞炎性蛋白3α)对免疫性T细胞具强有力的趋化作用，并可活化和趋化淋巴细胞，已经成为皮肤炎症疾病中的新靶点。本研究考察了IL-17与TNF-α共作用角质形成细胞分泌MIP-3α、IL-6、IL-8的影响。结果显示，角质形成细胞可分泌少量的MIP-3α、IL-6、IL-8，IL-17对这些炎症因子的产生起积极作用，IL-17与TNF-α共作用对皮肤细胞炎症因子的表达有明显促进作用。这可能是IL-17与TNF-α共作用致炎作用显著增强的重要原因。

综上所述，IL-17与TNF-α共作用可通过协同促进IL-17R的表达，进而协同促进p38 MAPK的磷酸化过程而具有显著的致炎作用。

参考文献

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通信作者：吴新安，男，副主任药师，硕士生导师，研究方向：医院药学，E-mail:xinanw@21cn.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.020

(收稿日期：2016-02-11，修回日期：2016-04-08)

Co-effect of IL-17 and TNF-α on the expressions of IL-17R,p-p38 MAPK andinflammatory factors in cultured keratinocytes

SHEN Kuiya,LIU Mei,WU Xinan

(DepartmentofPharmacy,105thHospital,Hefei,Anhui230031,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the co-effect of IL-17 and TNF-α on the expressions of IL-17R,p-p38 MAPK in skin keratinocyte cell line HaCaT cells,and on the levels of IL-6,IL-8,MIP-3α secreted by HaCaT cells.MethodsRT-PCR method was applied to analyze the expression of IL-17R mRNA in HaCaT cells treated with IL-17 and TNF-α in combination;Western blot method to study the expression of p-p38 MAPK;ELISA assay to analyze the level of inflammatory factors IL-6,IL-8 and MIP-3α.ResultsCo-effect of IL-17 and TNF-α could increase the expressions of IL-17R and p-p38 MAPK in HaCaT cells,as well as increase the levels of IL-6,IL-8,MIP-3α secreted by HaCaT cells.ConclusionsCo-effect of IL-17 and TNF-α can promote the expression of IL-17R,stimulate the phosphorylation of p38 MAPK,and increase the expressions of IL-6,IL-8,MIP-3α.So co-effect of IL-17 and TNF-α have played a significant proinflammatory role.

Key words:Interleukin-17;Tumor Necrosis Factor-alpha;AMP-Activated Protein Kinases;Chemokine CCL20;Interleukin-6;Interleukin-8