液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中千层纸素的浓度

徐卫峰，费逸明，何丹，尹恒,2

(1.南京中医药大学无锡附属医院药物临床试验机构，江苏 无锡　214071；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京　210023)



液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中千层纸素的浓度

徐卫峰1，费逸明1，何丹1，尹恒1,2

(1.南京中医药大学无锡附属医院药物临床试验机构，江苏 无锡214071；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京210023)

摘要：目的建立快速且灵敏的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定大鼠血浆中千层纸素的浓度。方法色谱分离采用C18色谱柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸铵(77∶23,V/V)为流动相，流速1.05 mL·min-1。大鼠血浆加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶，37℃孵化过夜，再加入内标染料木素及0.1%磷酸溶液，用乙酸乙酯提取，上清液40 ℃水浴中氮气流吹干，以流动相200 μL溶解残渣，进行分析。检测器采用四极杆串联质谱仪，离子源采用电喷雾电离离子源(ESI)，检测方式采用选择反应检测扫描(SRM)，检测离子：千层纸素[M+H]+ 284.9→269.9，内标[M+H]+ 270.9→270.9。结果千层纸素在5～1 000 μg·L-1范围内，线性关系良好，回收率大于85%，日内和日间的相对标准偏差(RSD)小于15%。结论建立的LC-MS/MS法符合生物样品分析的要求，可用于研究大鼠灌胃千层纸素后血浆中千层纸素的测定。

关键词：黄芩；串联质谱法；千层纸素A；大鼠,Sprague-Dawley

黄芩(拉丁学名：ScutellariabaicalensisGeorgi)，别名山茶根、土金茶根，是唇形科黄芩属多年生草本植物，根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效,主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痈肿疖疮等症。黄芩中的主要黄酮类化合物有黄芩苷(baicalin)、黄芩苷元(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)、汉黄芩苷(wogonoside)、千层纸素(oroxylin A)等[1-2]。研究表明,上述黄酮类化合物有较强的药理活性[3-6]，其中千层纸素具有广泛的生物活性，兼有抗炎、抗休克、抗肿瘤以及保护心脑血管等功效，是目前国内外研究的一个热点[4-11]。

由于在体内大多数黄酮类化合物以葡萄糖醛酸结合物的形式存在，要满足一定的灵敏度来检测其游离原型药物浓度存在诸多困难。有报道，通过酶水解的方式来测定原形药物和结合药物的总浓度，是可行的[12]。关于药物中千层纸素的含量测定方法较为成熟，但其血药浓度的测定有文献报道采用超高效液相色谱-二极管阵列法(UPLC-DAD)[13-14]，运用LC-MS/MS法却鲜有报道。本文利用LC-MS/MS法，快速而灵敏地测定了灌胃给药后大鼠血浆中千层纸素的血药浓度,并有利于进一步的药代动力学研究[15]。

1　材料

1.1药品与试剂千层纸素对照品(上海源叶生物科技有限公司，纯度>99.0%，批号：20140512)，染料木素作为内标(上海同田生物有限公司，纯度>99.0%，批号：20140311)，β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(美国Sigma公司，G1512，Type H-5，批号：232-606-8)，甲醇(美国Merck公司，色谱纯，批号：I603010 -136)，醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20140603)，实验用水为超纯水(自制)。

1.2仪器及测试条件Finnigan Surveyor LC-TSQ Quantum Ultra AM 液相色谱-三级串联四极杆质谱(LC-MS/MS)系统(Thermo Finnigan)。

色谱-质谱条件：采用Hanbon Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)色谱柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸铵(77∶23，V/V)为流动相，流速1.05 mL·min-1，柱温20℃，分流比3∶1。电喷雾离子化，正离子SRM检测；喷口电压5 kV，雾化气压35 kPa，辅助气压5 kPa，毛细管温度300 ℃，CID碰撞能量-8eV；用于定量的SRM检测离子为：千层纸素[M+H]+284.9→269.9，染料木素[M+H]+270.9→270.9。见图1。

1.3实验动物健康SD大鼠，雌雄各半，体重220～240 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物饲养许可证号SYXK(苏)2013-0008。

2　实验方法

2.1溶液制备千层纸素工作溶液：精密称定千层纸素对照品，在量瓶中加甲醇溶解并稀释，制成千层纸素浓度为1 g·L-1的溶液，再分别用甲醇稀释成千层纸素浓度为0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 mg·L-1的系列工作溶液。

内标溶液：精密称定染料木素，在量瓶中加甲醇溶解并稀释，制成染料木素浓度为200 mg·L-1的内标溶液。

2.2血浆样品处理取大鼠血浆(肝素抗凝处理)200 μL置5 mL离心管中，加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(100/4 U·mL-1)50 μL，涡旋混合15 s，经过37℃孵化过夜，然后依次精密加入内标溶液5 μL、0.1%的磷酸100 μL，分别涡旋混合15 s，再加入乙酸乙酯2 mL，涡旋混合3 min，离心5 min(10 000 r·min-1)，分取上清液1.6 mL，置40℃水浴中用氮气流吹干，以流动相200 μL溶解残渣，涡旋混合3 min，离心5 min(10 000 r·min-1)，取20 μL进行LC-MS/MS分析。

图1　千层纸素(A)和染料木素(B)的全扫描质谱图

　

(A)大鼠空白血浆；(B)大鼠空白血浆中添加千层纸素和内标(浓度分别达到5 μg·L-1)；(C)大鼠灌胃千层纸素后的血浆。色谱峰：内标(上)，千层纸素(下)。

图2LC-MS/MS法测定大鼠血浆中千层纸素的典型色谱图

2.3方法特异性考察取大鼠空白血浆、添加千层纸素和内标的血浆、给药后血浆样品各200 μL按“血浆样品处理”项下方法进行处理，测定结果如图2。千层纸素和内标的保留时间分别约为5.0 min和3.0 min，内源性物质不干扰千层纸素和内标色谱峰。

2.4标准曲线和定量下线取大鼠空白血浆200 μL，分别加入千层纸素系列工作溶液20 μL，制成千层纸素浓度各为5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1的血浆样品，按“血浆样品处理”项下方法操作。通过加权(1/C2)最小二乘法进行线性回归，横坐标为千层纸素血浆浓度(μg·L-1)，纵坐标为千层纸素与内标峰面积之比(Ri)。结果显示，千层纸素血浆样品标准曲线的回归方程为Ri=0.0029C+0.0576，r=0.996 6，线性范围为5～1 000 μg·L-1,定量下限为5 μg·L-1。

2.5回收率试验取3支洁净离心管，分别加入浓度为0.1、0.5、2 mg·L-1的千层纸素系列工作溶液20 μL，按“血浆样品处理”项下方法操作，测得Rs=样品/内标峰面积比。另取3支洁净离心管，分别加入大鼠空白血浆200 μL和千层纸素系列工作溶液20 μL，制成千层纸素浓度各为10、50、200 μg·L-1的血浆样品，按同法操作，测得Ri=样品/内标峰面积比。平行做5份，按照回收率R(%)=(Ri/Rs)×100%计算，3个不同浓度水平下的千层纸素回收率均大于85%。结果见表1。

表1　大鼠血浆中千层纸素的回收率(n=5)

2.6精密度和准确度另取3支洁净离心管，分别加入大鼠空白血浆200 μL和千层纸素系列工作溶液20 μL，制成千层纸素浓度各为10、50、200 μg·L-1的血浆样品，按“血浆样品处理”项下方法进行测定，平行做5份，考察血浆样品中测定千层纸素的精密度和准确度，所得结果表明该检测方法的精密度和准确度均良好。见表2。

2.7基质效应的考察取6只大鼠的空白血浆，不加内标，按“血浆样品处理”项下操作，挥干后加适量千层纸素工作溶液，加流动相200 μL溶解残渣，制成浓度为10、50、200 μg·L-1的溶液，每个浓度进样5次，得到峰面积B；再用相同比例溶剂配制成浓度为10、50、200 μg·L-1的千层纸素溶液后进样，得到峰面积为A。待测物的基质效应(%)=B/A×100%，内标亦按上法考察。计算B/A均在85%～115%范围内，表明基质效应对本法无干扰。

2.8血浆样品稳定性考察不同条件下千层纸素浓度各为10、50、200 μg·L-1的血浆样品的稳定性。结果显示，千层纸素血浆样品在室温(18℃)条件下保存12 h的浓度降低小于5%，在冷冻(-20℃)条件下放置2周无明显损失并且经3次反复冻融后测定千层纸素稳定性良好。

2.9动物实验分组及过程取SD大鼠6只，雌雄各半，实验前10 h禁食但可饮水，按40 mg·kg-1剂量灌胃给药。于给药前0 min及给药后10、40 min，1.5、3、5、8、12、24、30、36、48、54、60 h由眼眶后静脉丛取血约0.4 mL，在肝素化离心管中离心获取血浆样品，于-20 ℃条件下保存待分析。

3　结果

3.1方法学评价本实验采用LC-MS/MS对血浆中千层纸素浓度进行测定。血浆中内源性杂质无干扰，回收率>85%，日内、日间变异系数<15%，定量下限为5 μg·L-1，标准曲线的相关系数r>0.99，质控样本和冻融试验均符合标准。

3.2血药浓度-时间曲线和药代动力学参数按血浆样品测定方法对样品进行处理与测定，依照标准曲线计算浓度，所得血药浓度-时间曲线如图3，药代动力学参数见表3。结果显示，大鼠灌胃给药千层纸素后，24 h后达到最大血药浓度，且最大血药浓度为105.93 μg·L-1，消除半衰期约为6.6 h。

4　讨论

本实验采用LC-MS/MS法测定大鼠灌胃后血浆中千层纸素的血药浓度。血浆样品经有机溶剂提取上清液，在氮气流下吹干，以流动相溶解残渣的处理方法，可以提高待测样品的稳定性和检测灵敏度，大大缩短检测时间，同时消除了内源性杂质的干扰。实验结果表明本法线性、回收率、精密度和准确度均良好，且无基质效应的影响。

表2　大鼠血浆中千层纸素的精密度和准确度(n=5)

图3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千层纸素后千层纸素 平均血药浓度-时间曲线图表3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千层纸素后血浆中 千层纸素的药代动力学参数

参数测定值 Vc/Fmg/μg·L-1 0.152019 Cmax/μg·L-1 105.9284 Tmax/h 24 t1/2/h 6.603148 AUCt/h·μg-1·L-1 2992.567 AUCi/h·μg-1·L-1 3019.155 MRT/h 19.91949

本研究的候选内标包括雌二醇、氢化可的松、灯盏乙素、异鼠李素和染料木素，其中结构与千层纸素较相似的有雌二醇和染料木素。而在相同液相条件下，雌二醇与千层纸素的保留时间相似，峰重叠，故染料木素为最佳内标[16]。

本实验对灌胃给药后大鼠血浆中千层纸素浓度进行测定，结果显示SD大鼠口服千层纸素后，在血中迅速地转化为葡萄糖醛酸结合物或硫酸结合物，测得的千层纸素游离药物浓度基本低于定量下限。考虑无法获得千层纸素葡萄糖醛酸结合物或硫酸结合物的对照品，故加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶在37℃下孵化过夜后，使结合物水解为游离原型药物，测得的千层纸素原型药物浓度在线性范围之内[17]。千层纸素血药浓度的测定区别于黄芩类其他组分的测定[18-19]，分别同时测定千层纸素的游离药物浓度和结合药物浓度相对困难。与文献报道一致[20]，本实验采用了β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶水解法来处理大鼠血浆样品，成功地采用LC-MS/MS法测定了大鼠血浆中千层纸素的血药浓度，对人体千层纸素药代动力学的研究有一定参考价值。

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通信作者：尹恒，男，博士，副主任中医师，研究方向：中医药临床和药物研究，邮箱：yh_go@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.010

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-07)

Determination of oroxylin A in rat plasma by LC-MS/MS

XU Weifeng,FEI Yiming,HE Dan,et al

(DrugClinicalTrialInstitution,WuxiHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,

Wuxi,Jiangsu214071,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid and sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method for determination of oroxylin A in rat plasma.MethodsChromatographic separation was achieved on a C18column and the mobile phase consisted of methanol and 10 mmol·L-1ammonium acetate buffer(77∶23,V/V) pumped at a flow rate of 1.05 mL·min-1.The rat plasma samples by enzymatic hydrolysis using β-glucuronidase/sulfatase under 37 ℃ for the night were partitioned with ethyl acetate and centrifuged for sample clean-up after genistin used as internal standard(I.S.) and 0.1% phosphoric acid were added.The supernatant was then evaporated to dryness,and the residue was dissolved in 200 μL of mobile phase and analyzed.The quadrupole tandem mass spectrometer with electrospray ionization ion source(ESI) was performed in the selected reaction monitoring(SRM) mode and the transitions selected for quantitation were [M+H]+ 284.9→269.9 for oroxylin A and [M+H]+ 270.9→270.9 for genistin(I.S.),respectively.ResultsA linear calibration curve for assay of oroxylin A in rat plasma was obtained in the range of 5～1 000 μg·L-1with the recoveries of at least 85% and intra-day and inter-day RSD of 15%.ConclusionThe method can be used for thedetermination of oroxylin A in rat plasma after intragastric administration.

Key words:Scutellaria baicalensis；Tandem Mass Spectrometry;Oroxylin A；Rats,Sprague-Dawley