长链非编码RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定

孙笑笑，王科，张彦

(1.无锡市第三人民医院，江苏 无锡　214041；2.重庆医科大学附属永川医院，重庆　402160；3.重庆医科大学，重庆　400016)



长链非编码RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定

孙笑笑1，王科2，张彦3

(1.无锡市第三人民医院，江苏 无锡214041；2.重庆医科大学附属永川医院，重庆402160；3.重庆医科大学，重庆400016)

摘要：目的制备shRNA干扰人长链非编码RNA Linc00461的慢病毒载体(shRNA-Linc00461)，为进一步深入研究长链非编码RNA的功能奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计，根据小干扰RNA的设计原则，选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-Linc00461质粒。用PCR及测序对其进行鉴定，之后与慢病毒包装质粒混匀，由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装，产生慢病毒shRNA-Linc00461，收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过RT-PCR鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231细胞，运用MTT和流式细胞术检测细胞增殖和周期的改变。结果SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经PCR验证和测序后，证实其构建成功。shRNA-Linc00461在HEK293T细胞中重组成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231，感染效率约为70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后Linc00461的表达下调65.32%； 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 结果显示：实验组吸光度值(0.232±0.032)明显低于实验对照组(0.398±0.037)。流式结果提示实验组G2M 期细胞(47.55±5.063)%高于实验对照组(8.876±3.565)%。结论成功构建了shRNA-Linc00461慢病毒载体，并能有效抑制Linc00461表达，为深入研究人Linc00461基因功能奠定了基础。

关键词：RNA,小分子干扰;乳腺肿瘤;慢病毒属

在女性恶性肿瘤中，最常见的是乳腺癌，占第一位。其中中青年妇女乳腺癌的发病率呈逐年上升状态[1]。乳腺癌是一个多基因多因素参与的复杂性疾病,病理机制极其复杂，乳腺癌的诊断目前主要是依据蛋白类肿瘤标志物的筛查和影像学检查。一般乳腺癌病人发现的时候很多都是中晚期，临床治疗上有很大的难度，所以对于乳腺癌来说，做到早期发现早期治疗显得尤为重要。乳腺癌的发生往往是由遗传因素和环境因素共同作用的，近年来，在遗传研究方面,全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)和基于候选基因的单核苷酸基因多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)关联研究找到一些与乳腺癌相关的遗传变异[2]。研究者发现表观遗传学在乳腺癌的发生和发展机制中发挥着极其重要的作用。

长链非编码RNA lncRNA(long non-coding RNA) 是一类长度大于 200 nts且不编码蛋白质的RNA分子。lncRNA能通过形成复杂的二级甚至更高级结构来发挥多种生物学功能。lncRNA在生物体中可通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在转录、转录后或表观遗传学水平发挥一定的调节作用。近来研究发现，lncRNA作为一种表观遗传修饰类型，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[3]。最近报道LncRNA UCA1在膀胱癌组织中呈现表达上调，过表达UCA1可以促进BLS-211细胞的增殖、侵袭和迁移现象，王帆等人在卵巢癌SKOV3细胞中过表达UCA1能促进其侵袭、迁移而且这种现象与MMP2和MMP9的表达上调有关[4]。王铭辉课题组发现lncRNA HOTAIR在食管鳞状细胞癌组织中的表达明显升高，HOTAIR表达与食管鳞状细胞癌的临床分期、浸润深度、有无淋巴结的转移及其分化程度密切相关[5]。另有研究报道SChLAP1 能够通过拮抗具有肿瘤抑制作用的 SWI/SNF 复合体来促进前列腺癌的浸润和转移，导致前列腺癌相关死亡率升高。lncRNAs-uc001lsz 的表达与胃癌的 TNM 分期具有较高的关联性，可作为胃癌早期诊断的潜在生物学指标。

课题前期研究发现Linc00461在乳腺癌中呈现高表达状态，那么Linc00461在乳腺癌中是否发挥着一定的作用呢？Linc00461的升高是否会影响着乳腺癌细胞的增殖和周期的改变呢？为此，课题通过靶向RNA干扰技术研究Linc00461在乳腺癌中的具体作用。

1　材料与方法

1.1材料pSIH1-H1质粒(美国SBI公司)；乳腺癌MDA-MB-231细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；STBL-3菌种、HEK293T细胞(重庆医科大学附属永川医院分子医学实验室)；Trizol，脂质体转染试剂盒，L15培养基(Life公司)；试验中所用引物，普通PCR和DNA连接试剂盒(大连宝生物技术有限公司)；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4连接酶(New England Biolab公司)；质粒小抽试剂盒和DNA纯化试剂盒(Omega公司),逆转录试剂盒(Promega公司)。

1.2方法

1.2.1shRNA干扰LINC00461引物和阴性对照引物的获得将人Linc00461的mRNA基因(GenBank序列号为NR_015436.1)mRNA区输入至Life RNA在线设计干扰网页中，按照小干扰RNA的设计原则，选取三对干扰引物作为实验组，同时设计一对完全随机引物作为阴性干扰对照组，将选取的干扰引物按照shRNA的构成原则，中间以TCAAGAG为颈环结构。两端添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。合成的DNA分别命名为shRNA-Linc00461的和shRNA-Negtive。表1。

表1　 shRNA Linc00461干扰序列设计

1.2.2干扰质粒PCR验证引物的设计Linc00461干扰质粒PCR验证引物上游5’AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’;下游5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’，未插入干扰片段质粒扩增长度105 bp，插入干扰片段后质粒扩增长度为161 bp,Linc00461PCR 上游引物：5’-GCGTGGACTACTCTGATG-3’下游引物：5’-CACCCAAGTGCTTACTGTCT-3’扩增长度192 bp;GAPDH上游引物：5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’,下游引物：5’-TGAGGTCCACCACCCTGT -3’扩增长度122 bp。

1.2.3shRNA-LINC00461和shRNA-Negtive基因与载体pSIH1-H1的连接BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pSIH1-H1质粒，酶切产物经纯化后与DNA连接试剂盒连接，shRNA-Linc00461基因连接产物命名为pSIH1-H1-shRNA-Linc00461，shRNA-Negtive基因连接产物命名为pSIH1-H1-shRNA-Negtive。

1.2.4pSIH1-H1-shRNA-LINC00461和pSIH1-H1-shRNA-Negtive质粒的鉴定以上连接产物经Cacl2化转入STBL-3菌，接种于LB平板，37℃培养过夜后挑取单个菌落增菌培养12 h后提质粒，取5 μL菌落进行PCR鉴定， 取10 μL送南京金斯瑞有限公司进行测序。

1.2.5shRNA干扰慢病毒(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive)的包装将测序正确的干扰质粒和慢病毒包装质粒按慢病毒包装质粒试剂盒混匀，并将以上产物与Lipofectamine 2000转染入HEK293T细胞，37℃，5%CO2培养，适时观察荧光表达量， 48 h后离心，收集上清至无菌EP管备用。

1.2.6重组干扰慢病毒在MDA-MB-231中干扰效果的测定收集包含病毒颗粒的培养液加入到MDA-MB-231中，24 h后观察慢病毒感染荧光的表达情况，并提取细胞总RNA。在RNA水平观察干扰效果。

1.2.7慢病毒感染与荧光观察MDA-MB-231细胞密度达到70%～80%时加入慢病毒干扰颗粒。设空白对照组(MDA-MB-231)、GFP感染组、阴性对照感染组、慢病毒干扰组。加病毒24h后观察各组的荧光表达情况。

1.2.8逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Trizol法提取各组细胞的总RNA，逆转录成cDNA,以cDNA为模板进行PCR。反应条件为:94℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共30个循环;最后72 ℃延伸5 min。行琼脂糖凝胶电泳后成像结果用Qunantity One软件进行分析,目的基因LncRNA相对表达量以目的基因条带的灰度值/内参条带灰度值表示。

1.2.9MTT 检测细胞增殖将前期感染慢病毒细胞及各对照组细胞，以5×106个/L 的密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，每组设5 个平行孔，细胞培养1～5 d 后分别在酶联免疫检测仪上波长492 nm 处对各孔进行吸光度(D)值的检测。

1.2.10流式检测细胞周期的改变收集慢病毒感染MDA-MB-231 后3天的各组细胞， 经过消化，离心，洗涤，重悬后收集于1.5 mL EP 管中，上流式细胞仪检测细胞周期。

2　结果

2.1shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive的鉴定经PCR初步验证后在200 bp左右有条带，认为连接成功(图1)，送公司测序并将测序结果比对后，证明质粒完全构建成功，实验流程以shRNA-Linc00461-1构建过程为例说明。

图1　shRNA-Linc00461-1PCR检测结果

2.2shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒在MDA-MB-231细胞中的感染情况将收集于EP管内的病毒液(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒)加入直径为6 cm细胞密度为60%～80%的MDA-MB-231培养皿中，24 h后观察细胞的荧光表达情况，镜下可见荧光表达量约为70%(图2)。

图2　 MDA-MB-231中加入shRNA-Linc0046-1、 shRNA-Negtive荧光表达情况(×100)

2.3shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive在RNA水平的表达慢病毒感染MDA-MB-231后，24 h提取细胞总RNA，通过RT-PCR检测linc00461干扰慢病毒的干扰效果。慢病毒感染24 h后，感染效率均约70%。RT-PCR显示shRNA-Linc00461-1、shRNA-Linc00461-2和shRNA-Linc00461-3组细胞Linc00461 RNA 的表达较shRNA-Negtive组均有所降低(图2)，分别降低了52.17%、56.37%和65.32%，由此可见shRNA-Linc00461-3的干扰效果最好，故选取shRNA-Linc00461-3用于做后续实验。RT-PCR结果提示：干扰慢病毒载体构建成功(图3)。

注：1：shRNA-Negtive；2：shRNA-Linc00461-1；3：shRNA-Linc00461-2；4：shRNA-Linc00461-3。

图3干扰慢病毒对Linc00461基因的沉默效果

2.4MDA-MB-231中干扰Linc00461的表达对细胞增殖和周期的影响慢病毒感染MDA-MB-231第3天，MTT 结果显示：干扰组吸光度值(0.232±0.032)明显低于实验对照组(0.398±0.037)，第5天，干扰组吸光度值(0.378±0.042)明显低于实验对照组(0.631±0.047)(P<0.05)。慢病毒感染MDA-MB-231的第3天，细胞周期阻滞在G2M期，干扰组G2M 期细胞(47.55±5.063)%高于阴性对照组(8.876±3.565)%(P<0.05)。结果提示Linc00461参与了MDA-MB-231细胞的增殖及周期过程(图4)。

注：(A)RT-PCR检测shRNALinc00461的干扰效果，(B)干扰Linc00461对细胞增殖的影响，(C)干扰Linc00461对细胞周期的影响。

图4 shRNALinc00461的干扰效果及干扰Linc00461后对MDA-MB-231增殖、周期的影响

3　讨论

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤(全世界每年有大约50万人死于乳腺癌)，是一个多基因多因素参与的复杂性疾病,病理机制极其复杂，越来越多的学者致力于乳腺癌发病机理的研究。近年来，研究者发现表观遗传学在乳腺癌的发生和发展中发挥着着重要作用[6-8]。

LncRNA作为一种重要表观遗传修饰类型，在许多肿瘤中存在异常的表达，是肿瘤发生的一类重要因素。目前，对LncRNA的研究尚处于起步阶段，其可能的来源包括(1)蛋白质编码基因的结构中断；(2)染色质重组；(3)非编码基因通过逆转录转座子进行复制的产物；(4)非编码 RNA 发生相邻的串联复制；(5)基因组中转座因子的插入产生功能性非编码 RNA[9-10]。研究发现含有端粒重复单元的 RNA 序列与乳腺癌细胞的无限增殖能力相关；BCAR4与乳腺癌内分泌治疗雌激素抵抗相关；HOTAIR 的表达量可作为预测乳腺癌转移及预后的有效指标；LOC554202可以通过启动子甲基化影响下游基因而调控乳腺癌的转移；抑制ARA的表达可以降低乳腺癌化疗中阿霉素的耐药耐药率[11]。张霞等人通过lncRNAs 表达谱也找到一些与乳腺癌密切相关的长链非编码RNA[12]，而且有学者研究发现长链非编码RNA SPRY4-IT1可通过上调乳腺癌基因ZNF703表达来促进乳腺癌增殖[13]。H19 高表达影响细胞周期进程，促进细胞增殖与转移[14-15]，LSINCT5 高表达可增加乳腺癌细胞增殖能力[16]，而对于Linc00461，国内罕有报道，有学者认为它与抑郁症相关，我们前期探索发现Linc00461在乳腺癌细胞中表达广泛，Linc00461可能参与乳腺癌恶性转化过程。随后通过SBI公司第四代慢病毒包装系统，利用干扰在线设计网页，设计三对针对Linc00461的短发卡RNA，并成功包装成干扰慢病毒。经RT-PCR发现三对短发卡RNA对Linc00461均有干扰效果，shRNA-Linc00461-1(52.17%)、shRNA-Linc00461-2(56.37%)和shRNA-S Linc00461-3(65.32%)，shRNA-Linc00461-3干扰效果最好。干扰慢病毒感染MDA-MB-231细胞后发现其增殖能力明显减弱，细胞周期检测显示细胞G2M期增多，表现为G2M期阻滞，初步证实Linc00461在乳腺癌增殖中的作用。

Linc00461干扰慢病毒的成功构建为后续研究Linc00461功能做了良好的铺垫，进而可深入研究Linc00461在乳腺癌中的作用机制，为乳腺癌的治疗寻找新的靶点新的思路。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(81172017)；重庆市教委课题(KJ1500202)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.021

(收稿日期：2016-04-20，修回日期：2016-05-09)

Construction and identification of recombinant lentivirus vector interferring the expression of long non coding RNA Linc00461

SUN Xiaoxiao1,WANG Ke2,ZHANG Yan3

(1.WuxiNo.3People’sHospital,Wuxi,Jiangsu214041,China;2.YongchuanAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;3.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector interfering human Linc00461 gene for its further research.MethodsShort hairpin RNA(shRNA) targeting Linc00461 gene was designed and DNA template was synthesized and subcloned into the Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1.The recombinant plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was confirmed by PCR and gene sequencing.Then pSIH1-H1-Linc00461 and Lentiviral packaging plasmid was transfected into HEK293 cells for packaging by liposome.And supernatant culture medium was collected to infect MDA-MB-231 breast cancer cells.shRNA-Linc00461 was identified by RT-PCR.Breast cancer cells MDA-MB-231 were transfected with shRNA-Linc00461 and the cells proliferation and change cell cycle were detected by MTT and FCM.ResultsThe recombinant Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was successfully constructed.The recombinant Lentivirus vector shRNA-Linc00461 could be packaged in HEK293T and infected MDA-MB-231 successfully.The expression of Linc00461 gene was reduced by 65.32% when the breast cancer MDA-MB-231 cells were infected by shRNA-Linc00461.MTT assay showed that cell proliferation capacity decreased from (0.5780±0.047)to(0.432±0.042) and blocked cell cycle in G2M Phase was(47.55±5.063)%,higher than(8.876±3.565)% in control group.ConclusionsThe recombinant Lentivirus vector interfering Linc00461 gene was successfully constructed and inhibited the expression of Linc00461,which laid foundation for further research of Linc00461.

Key words:RNA,Small Interfering;Breast Neoplasms;Lentivirus