正交试验法优选芪贞降糖颗粒提取工艺

丁丽玉，张丹，许莹，吴飞2d

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,a药剂科，b内分泌科，上海　200437；2.上海中医药大学,c中药学院，d中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海　201203)



正交试验法优选芪贞降糖颗粒提取工艺

丁丽玉1a，张丹1b，许莹2c，吴飞2c2d

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,a药剂科，b内分泌科，上海200437；2.上海中医药大学,c中药学院，d中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海201203)

摘要：目的优选芪贞降糖颗粒的提取工艺。方法采用HPLC法测定枸橼酸、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量；以3个成分转移率和出膏率为指标，通过L9(34 )正交试验考察加水量、提取时间、提取次数对提取工艺的影响，并设计了验证试验。结果最佳提取工艺条件为加10倍量水提取3次，每次1.5 h。结论优选的提取工艺稳定可行，提取率高。

关键词：正交试验；黄芪；女贞子；中药工艺改进

芪贞降糖方是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内分泌科用于治疗Ⅱ型糖尿病或糖调节异常的协定方，由乌梅、灵芝、黄芪和女贞子4味中药组成，其中乌梅为君，灵芝为臣，黄芪和女贞子为佐使。配伍合理，组方精炼，临床应用10余年，在改善患者胰岛素抵抗、调节糖代谢等方面疗效显著[1-6]。

沿袭临床用法，本实验采用水提取工艺，对溶剂用量、提取时间、提取次数等因素进行系统考察，以枸橼酸、特女贞苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷[7]转移率以及出膏率作为监控指标，采用正交试验法[8-9]对芪贞降糖颗粒的提取工艺进行优选并验证，得到最佳提取工艺参数，为处方的整个制剂工艺奠定基础。

1　材料

1.1仪器1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Kromasil 100-5C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，FA2104N型电子天平(0.1 mg,上海精密科学仪器有限公司)，XP205型电子天平(0.01mg，梅特勒-托利多中国有限公司),DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，TGL-18C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HWS26型水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2试药枸橼酸(批号100396-201302)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号111920-201102)，特女贞苷对照品(批号111926-201404)：均购自中国药品生物制品检定所。

黄芪(批号141210，甘肃)，制乌梅(批号140913，浙江)，制女贞子(批号141125，湖南)，灵芝(批号141105，山东)：均购自上海康桥药业有限公司。

2　方法

2.1出膏率的测定取200 mL水煎液，减压浓缩后转移至已恒重的干燥蒸发皿中，水浴(105℃)蒸至近干，置真空烘箱80℃下减压干燥至恒重，计算出膏率。

2.2枸橼酸的含量测定

2.2.1色谱条件流动相为0.1%磷酸溶液，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，波长210 nm，对照品进样10 μL，样品进样5 μL。见图1。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取枸橼酸对照品适量，加甲醇制成浓度为0.5290 g·L-1的溶液。

2.2.3供试品溶液的制备按处方比例分别称取乌梅、灵芝、黄芪和女贞子，以水煎煮提取，提取液高速离心5 min后，取上清液进行HPLC测定。同法制备缺乌梅的阴性样品。

2.2.4精密度试验精密吸取枸橼酸对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积。峰面积RSD为0.2%，说明进样精密度良好。

2.2.5线性关系考察分别精密吸取枸橼酸对照品溶液0.5，1，2，5，10，20和50 μL，进行HPLC分析，以进样质量对峰面积进行线性回归，得回归方程Y=65.222 4X+2.021 4(r=1.000 0)，表明枸橼酸进样质量在0.26～26.45 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3特女贞苷的含量测定

2.3.1色谱条件流动相为水∶甲醇(60∶40)，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，波长224 nm，对照品进样2.5 μL，样品进样10 μL。见图2。

2.3.2对照品溶液的制备精密称取特女贞苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.2515 g·L-1的溶液。

2.3.3供试品溶液的制备按处方比例分别称取乌梅、灵芝、黄芪和女贞子，以水煎煮提取，高速离心5 min后，取上清液进行HPLC测定。同法制备缺女贞子的阴性样品。

2.3.4精密度试验精密吸特女贞苷对照品溶液2.5 μL，重复进样6次，记录峰面积。峰面积RSD为0.2%，说明进样精密度良好。

2.3.5线性关系考察分别精密量取对照品溶液0.2，0.5，1，2，5和10 μL，进行HPLC分析，以进样质量对峰面积进行线性回归，得回归方程Y=1164.9483X+29.2150(r=0.999 9)，表明特女贞苷进样质量在0.05～2.52 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定

2.4.1色谱条件[10]流动相为乙腈(A)和0.2%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0～13 min，13%～15% A；13～23 min，15%～20% A；23～30 min，20%～40% A；30～40 min，40%A)，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，波长260 nm，对照品1 μL，样品30 μL。见图3。

A：枸橼酸对照品

B：供试品

C：缺乌梅阴性样品

图1芪贞降糖颗粒提取液中枸橼酸测定的HPLC图谱

A：特女贞苷对照品

B：供试品

C：缺女贞子阴性样品

图2芪贞降糖颗粒提取液中特女贞苷测定的HPLC图谱

A：毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品

B：供试品

C：缺黄芪阴性样品

图3芪贞降糖颗粒提取液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷测定的HPLC图谱

2.4.2对照品溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成浓度为56.75 mg·L-1的溶液。

2.4.3供试品溶液的制备按处方比例分别称取乌梅、灵芝、黄芪和女贞子，以水煎煮提取，高速离心5 min后，取上清液进行HPLC测定。同法制备缺黄芪的阴性样品。

2.4.4精密度试验精密吸取枸橼酸对照品溶液1 μL，重复进样6次，记录峰面积。峰面积RSD为2.8%，说明进样精密度良好。

2.4.5线性关系考察精密量取上述对照品溶液0.2，0.5，1，2和5 μL，进行HPLC分析，以进样质量对峰面积进行线性回归，得回归方程Y=3.703 5X+1.958 2(r=1.000 0)，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样质量在11.35～283.75 ng 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5正交试验设计分别称取乌梅15 g、灵芝15 g、黄芪12 g和女贞子12 g，采用正交试验法优选水提取工艺，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，每个因素设3个水平，以特女贞苷、枸橼酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率和出膏率的综合评分为考察指标，每组平行处理2份。因素水平见表1。

表1　芪贞降糖颗粒的提取工艺正交试验因素水平表

3　结果

3.1正交试验正交试验结果见表2～5。

根据直观分析结果，对4个指标影响最大的因素是提取次数，其次为提取时间和加水倍量。枸橼酸转移率最佳的提取工艺为A3B3C3，毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率最佳的提取工艺为A3B3C3，特女贞苷转移率最佳的提取工艺为A3B3C2，出膏率最佳的提取工艺也是A3B3C3。

表3方差分析结果表明，提取次数对4个指标均有显著性影响，提取时间对毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率有显著性影响，加水倍量对特女贞苷的转移率有显著性影响。

表2　正交试验工艺及结果

注： 4个因素(A、B、C和D)中1、2和3指的是各因素的3个水平。

表3　方差分析结果

表4　提取工艺正交试验综合评分直观分析表

表5　提取工艺正交试验综合评分方差分析表

注：D为空白项，F0.05(2，2)=19.0。

综合4组结果，最佳因素水平组合略存在分歧，为统一结果，以枸橼酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷转移率的综合评分，对正交实验结果进行分析。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化处理，再根据各成分在处方中地位，乌梅是君药，黄芪和女贞子处方中均属佐使药，3药的用量接近，其活性成分的转移情况对判断工艺均具有重要的指导意义，故将枸橼酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷的权重系数均设为0.3。综合评分直观及方差分析结果如下表4、5。

表4直观分析结果表明，最佳因素水平组合为A3B3C3，对综合指标影响最大的因素是提取次数，其次为提取时间和加水倍量。

表5方差分析结果表明加水倍量无显著性影响，提取次数和提取时间均差异有统计学意义。需要设计验证实验进行最佳工艺的验证。

3.2验证试验对提取次数和提取时间进行扩大水平验证，同时对加水倍量进行扩展验证，实验设计和结果见表6。

比较第1组和第4组，随着提取次数增加1次，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和特女贞苷的转移率显著增加，但是枸橼酸却有明显下降，综合动力成本和工艺的可行性考虑，确定提取次数为3次。

表6　提取正交验证试验结果表

比较第1、2和3组，随着提取时间的继续增加，3个指标的转移率未能大幅度增加，选定提取时间为1.5 h。

比较第1组和第5组，随着提取溶剂体积的继续增加，特女贞苷转移率显著增加，毛蕊异黄酮葡萄糖苷基本无变化，但是枸橼酸有明显下降，最后选定加水倍量为10倍。

根据正交试验验证实验的结果，确定芪贞降糖颗粒的最佳提取工艺为：加水10倍量，提取3次，每次1.5 h。

4　讨论

根据新的中药制剂质量控制思路，需要选择能够特征性指示工艺可靠性的成分来监控制剂过程中的工艺变化。本处方包含4味药，本研究选择其中3味重要的药材中的水溶性良好的特征性成分结合出膏率作为正交试验考察的指标，可以有效筛选出最佳的制剂工艺。

女贞子中的指标性成分特女贞苷水溶性良好，但是提取效率不高，可能是因为女贞子药用部位是干燥的果实，质地硬实，特女贞苷不易浸出。一些研究[11-13]在制剂时预先将女贞子杂碎或者粉碎过筛，可以有效提高提取效率。但是笔者认为医院制剂若与临床用法保持一致，则首先需要保证处方成分的炮制或提取前处理方法一致，不能盲目为提高一些指标性成分而直接更改饮片的处理工艺，除非进行相应的制剂临床效果对比评价。

对于HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的方法，文献中已有一些报道[14-15]，主要分为等度洗脱、梯度洗脱，本文参考了李圆圆等[10]的分离条件。

之前的临床研究中，也曾委托加工单位进行制剂的加工，并以这些加工的颗粒进行相关的临床试验[3-6]，但是一直未有对处方比例进行固定，也未曾系统考察过制剂工艺。本研究首次系统对提取工艺进行考察，以正交试验优化最佳提取参数并验证，为将芪贞降糖方开发成为标准的医院制剂打下坚实的基础。

参考文献

[1]张丹,杨宏杰,詹可一.芪贞降糖方治疗2型糖尿病30例[J].陕西中医,2009,30(8):992-993.

[2]范朝华,杨宏杰,张丹,等.芪贞降糖方改善2型糖尿病胰岛素抵抗临床研究[J].浙江中医杂志,2011,46(10):715-716.

[3]张丹,郑敏,范朝华,等.芪贞降糖颗粒对糖调节异常患者的临床研究[J].海南医学,2011,22(12):49-50.

[4]张丹,杨宏杰,郑敏,等.芪贞降糖颗粒对糖调节异常患者的临床干预研究[J].时珍国医国药,2012,23(7):1744-1745.

[5]张丹,杨宏杰,郑敏,等.酸甘化阴法对2型糖尿病患者胰岛素抵抗作用的研究[J].浙江中医药大学学报,2015,39(9):671-674.

[6]张丹,杨宏杰,郑 敏,等.酸甘化阴法治疗2型糖尿病患者临床疗效及机制研究[J].辽宁中医杂志,2015,42(11):2136-2138.

[7]宋成英,封加福.HPLC同时测定黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(11):115-117.

[8]杨秀娟,洪燕龙,吴飞,等.正交试验优选止颤汤提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(9):21-24.

[9]袁天荣,赵雪梅,赵蕾,等.正交试验优选芪丹颗粒提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(7):4-8.

[10] 李圆圆,宋英,方芳,等.HPLC 测定益心通脉合剂中丹参素钠和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(22):64-67.

[11] 郭宇洁,任烨,葛争艳,等.正交试验法比较女贞子中齐墩果酸与特女贞苷的乙醇提取工艺[J].中成药,2013,35(20):277-281.

[12] 阮佳,贺英菊,詹雁,等.含女贞子复方中药的提取及干燥工艺研究[J].华西药学杂志,2013,28(3):278-280.

[13] 王莹,曹伟,贺俊杰,等.贞栀颗粒中女贞子提取效率的影响因素考察及醇提工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(24):32-35.

[14] 黄志勤,李洪亮,程齐来.HPLC测定黄芪药材中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷[J].光谱实验室,2012,29(5):2736-2738.

[15] 胡琨.HPLC测定芪肾口服液中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量[J].南京中医药大学学报,2014,30(2):195-196.

基金项目：上海市卫计委中医医院中药制剂能力提升项目(ZY3-JSFC-2-2017)

通信作者：吴飞，男，副研究员，研究方向：中药制剂分析和药物分析，E-mail:a1983d3891h@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.005

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-08)

Optimization of extraction process parameters for Qizhenjiangtang Granules by orthogonal test

DING Liyu1a,ZHANG Dan1b,XU Ying2,et al

(1a.DepartmentofPharmacy;1b.DepartmentofEndocrinology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.CollegeofChineseMaterialMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process parameters of Qizhenjiangtang granules．MethodsHPLC was used to determine the contents of citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-O-β-D-glycoside.With 3 component transfer ratios and solid contents as indexes,the parameters(amount of water,extraction time,times of extraction) on extraction technology were investigated by L9(34 ) orthogonal test．ResultsOptimal extraction technology conditions were as follows:extracted for 3 times with 10 folds the amount of water，1.5 h per time．ConclusionThe optimized extraction technology was stable and feasible with high extraction rate of the index components．

Key words:Orthogonal test；Astragalus membranaceus；Fructus ligustri lucidi；Technology improving(TCD)