盐酸抗原修复Brdu免疫组化检测在脑组织中的应用*

王　坦　郑婉君　高剑峰



【实验研究】

盐酸抗原修复Brdu免疫组化检测在脑组织中的应用*

王坦1郑婉君2高剑峰2

1.河南中医学院基础医学院病理教研室(郑州 450000); 2.河南中医学院基础医学院生理教研室(郑州 450000)

摘要：目的探索简单有效的Brdu免疫组织化学染色抗原修复方法，提高实验成功率和改善实验结果。方法通过实验对三种抗原修复方法：①水浴锅煮沸修复法，②微波修复法，③Hcl酸化破膜法，采集图像进行比较，探索出Brdu免疫组织化学DAB染色最有效方法。结果①水浴锅煮沸修复法：组织抗原暴露不全，背景较深，不能很好的显示Brdu的阳性结果。②微波修复法：组织中Brdu暴露不全，增加加热时间会使组织切片脱落严重，加热时间少则背景深，Brdu不能很好的与抗体结合，实验多数为阴性。③Hcl酸修复法：组织背景色较浅，Brdu阳性与背景色对比明显，同时能完全检测Brdu在细胞中的位置。结论Hcl酸化修复法能很好的显示细胞核DNA镶嵌的Brdu，抗体容易进入细胞核中与之结合，显色效果明显，操作简单易行，同时无热源，安全性较好，是一种较为理想的检测方法。

关键词：Brdu; 免疫组织化学；抗原修复

Brdu(5-Bromo-2-deoxyUridine 5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸)是一种参与细胞DNA(脱氧核糖核酸)合成的核苷酸类物质，一般Brdu作为跟踪剂用于细胞周期检测、细胞分裂增生和DNA合成检测[1]。细胞周期包括分裂期和分裂间期，在分裂间期的S期为DNA合成期，细胞核内DNA进行半保留复制，加入Brdu后，Brdu可进入新合成的DNA链中，在不受紫外线照射细胞存活情况下可以永久存在。通过检测Brdu可以得到细胞存活、分化和增生情况。因此Brdu常用于神经细胞修复的跟踪剂[2]。

动物实验经腹腔注射Brdu，通过腹膜吸收入血，通过血液运输进入神经细胞中。当神经细胞受损时，Brdu作为核酸类物质进入细胞核DNA中，参与DNA的复制。神经细胞受损越重但细胞不能死亡，Brdu进入细胞核DNA中越多，检测Brdu可以间接得到神经细胞受损和修复情况。而在检测石蜡组织中的Brdu表达，特别是在脑组织中检测，由于需要福尔马林的固定，抗原变性，背景色较重，Brdu表达对比较差。为了得到清晰图像我们进行三种抗原修复方法进行比较，为后期实验选出合适的修复方法打下基础。

1　材料和方法

1.1实验试剂和动物Brdu购自于Solarbio公司(批号：1029C031)，Brdu抗体来源于大鼠单克隆抗体购自于abcam公司(批号：ab6326)，山羊抗大鼠IgG购自于北京博奥森生物技术有限公司(批号：bs-0293 g-HRP)，辣根酶标记链霉卵白素工作液山羊血清购自于中杉金桥试剂公司(批号: SAP-9100)，DAB显色试剂盒购自于武汉博士德生物工程有限公司(批号AR1022)，小鼠 C57BL/6J，体质量15～25 g, 购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2动物模型制备选用健康清洁级的30日龄C57BL/6J小鼠100只，随机分为模型组(无电针)；非穴位组(电针针刺尾部)；电针穴位组(百会、风府、双侧肾俞)。放射线照射后次日开始电针刺激，第一次针刺干预开始后立即腹腔注射Brdu(40mg/kg)，每天1次，连续7天，末次Brdu注射后灌注取材。

1.3组织制备动物经2%戊巴比妥钠，0.1ml/10 g麻醉，心脏灌注福尔马林固定液固定，取脑组织，常规脱水石蜡包埋。

1.4抗原修复将石蜡组织切片2μm贴到粘附片上，共计33张，用水浴锅煮沸修复、微波修复和Hcl破膜暴露三种方法进行Brdu暴露[3]。 具体方法如下：石蜡切片脱蜡至水，把切片放入0.3%的H2O2溶液中浸泡20分钟，温度为37℃孵育，双蒸水洗2次，每次3分钟，温度37℃，去除内源性过氧化物酶，然后分别进行水浴锅煮沸修复、微波修复和Hcl修复。水浴锅煮沸法修复：将孵育好的切片11张放入0.01ml/L柠檬酸钠缓冲修复液中，置于电热炉上，待水沸腾后计时30分钟，放入PBS溶液中3次×3分钟。微波法修复：将孵育好的切片11张放入0.01ml/L柠檬酸钠缓冲修复液中，置于微波炉中，中火20分钟，放入PBS溶液中3次×3分钟。Hcl修复：将孵育好的切片11张放入2M 的Hcl中，室温10分钟，恒温箱37℃，20分钟，放入硼酸盐溶液(0.1M/L)中室温10分钟，恒温箱37℃，20分钟。PBS溶液洗3次×3分钟。

1.5免疫组织化学DAB染色[4]将三种抗原修复法修复后的切片用山羊血清封闭，37℃，15分钟，甩去多余血清，不洗。Brdu一抗浓缩液按梯度1/20、1/80、1/120、1/200和1/500浓度。PBS溶液稀释进行滴加,每个浓度抗体滴加2张，1张滴加PBS代替一抗作为阴性对照。4℃冰箱过夜，取出后室温30分钟。PBS溶液洗3次×3分钟，山羊抗大鼠二抗浓缩液用PBS溶液进行1/100和1/200梯度稀释分别滴加。PBS溶液洗3次×3分钟，滴加辣根酶底物，37℃，15分钟。PBS溶液洗3次×3分钟用双蒸水1ml加入浓缩双氧水2滴，DAB浓缩液2滴和DAB稀释液2滴配成DAB工作液进行DAB染色，室温下10分钟，镜下观察染色情况。PBS溶液洗3次×3分钟，双蒸水洗3分钟，苏木精复染，进入苏木精后2秒拿出，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶加入二甲苯进行稀释封片。

1.6图像采集用OLMPUS图像采集系统采集摄片[6]。

2.1水浴锅煮沸法修复结果根据图片显示(图A)，一抗浓度为1/80，二抗浓度为1/100切片中Brdu显色效果较好，但背景色和Brdu显色对比较差，浓度较高的切片中背景色较重，Brdu阳性结果对比较差，随着一抗浓度降低，背景色变淡，Brdu显色液变淡。

2.2微波修复结果显示(图B)，一抗浓度在1/80，二抗浓度为1/100切片中Brdu显色效果较好，但背景色较深，随着一抗浓度的降低，背景色变淡，同时Brdu显色变淡。

2.3 Hcl修复结果显示(图C), 一抗浓度在1/80，二抗浓度为1/100切片中Brdu显色效果好,背景色较浅，Brdu显示明显，随一抗浓度增加，背景色变深，对比性减弱。随一抗浓度降低背景色变浅，Brdu显色也随之变浅，不能明确的显示Brdu为阳性。

2.4PBS代替一抗结果显示(图D), 整张切片整体为阴性没有出现棕黄色，细胞核内无明显棕黄色颗粒，细胞质无着色。

2　结果

图A　煮沸修复法DAB×400图B　微波修复法DAB×400图C　Hcl酸化孵育法DAB ×400图D　PBS阴性DAB ×400

3　讨论

Brdu是一种类似于核酸样的物质，在细胞受到损伤的时候能够进入细胞核并参与DNA修复，取代胸腺嘧啶嵌入DNA双螺旋链其中一条链中，在细胞存活没有紫外线照射状态下Brdu能够持续长期存在。因此Brdu作为一种跟踪剂可以检测细胞的活性和增值状态。

免疫组织化学是目前最常用的蛋白检测方法[6]。在对组织进行石蜡包埋过程中，需要使用福尔马林溶液固定组织，造成细胞内的蛋白决定簇被醛基交联封闭以至于不能直接与抗体结合，所以在进行免疫组织化学检测的时候需要对抗原进行修复，打开被醛基交联的蛋白集团，暴露抗原。免疫组织化学常用的抗原修复有热修复、微波修复和胰蛋白酶消化修复等。但Brdu是位于细胞核中的DNA链中，常规的抗原修复很难把Brdu抗原暴露，因此应用常规免疫组织化学进行抗原修复后组织表达Brdu效果不理想，甚至出现阴性结果。

给予上述原因，我们通过2M Hcl溶液对细胞膜和核膜进行酸化破解，能够很好的解决一抗进入细胞核中的问题，因此Brdu的DAB染色也具有特异性。

在本实验中关键的步骤是Hcl的浓度和硼酸中和的时间和浓度，同时在进行粘附片吸附组织切片时一定要展开，无褶皱组织和载玻片能充分的接触，避免组织在修复过程中脱落或者卷起皱缩。

盐酸酸化破膜法检测Brdu，实验操作简单，过程基本上与常规免疫组织化学SP法相似，无需特殊的实验设备，操作简单，用时少，并且染色结果明显好于热修复和微波修复。

参考文献

[1]Tsuji T, Itoh M kikuchi R, Repeated exposure to 5-bromo-2'-deoxyuridine causes decreased proliferation and low-grade inflammation in the lungs of mice[J]. Experimental and Toxicologic Pathology,2015,21(15): S0940-2993.

[2]Asano M, Yamamoto T, Tsuruta T,Dual labeling with 5-bromo-2'-deoxyuridine and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine for estimation of cell migration rate in the small intestinal epithelium [J]. Dev Growth Differ, 2015;57(1):68-73.

[3]黄菊芳,刘晨,王慧，等. 一种改良的Brdu免疫组织化学染色抗原修复技术[J].现代生物医学进展,2011,11(10):1972-1974.

[4]纪小龙.新编免疫组织化学[M].北京：人民军医出版社,2005: 19.

[5]王伯沄.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社,2001: 368.

[6]潘琳.实验病理学技术图谱[M]. 北京：科学出版社，2012:302-343.

*基金项目：国家自然基金(No.81373852)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.10.023

文章编号：1003-8914(2016)-10-1398-03

收稿日期：(本文校对：武鑫2015-08-19)

Application Hydrochloric Acid Repair Antigen of Brdu in Immunohistochemical Detection in Brain Tissue

WANG Tan1ZHENG Wanjun2GAO Jianfeng2

(1.Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences of Henan University of TCM, Henan, Zhengzhou 45000, China;2.Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences of Henan University of TCM, Henan Zhengzhou 45000, China)

Abstract：ObjectiveTo get the simple and effective method that antigen of Brdu repair in immunohistochemical staining, and improve success rate and result of the experiment. MethodsBased on the three kinds of experimental antigen repair methods as follows: Boil repair, Microwave repair and Hcl acid repair. Comparison image from Olympus image acquisition system, explore the most effective method of Brdu in immunohistochemistry detection by DAB staining. ResultBoil repair method: tissue antigen exposure was not complete, and the background was dark, display of Brdu positive results was not good. Microwave repair method: The organization exposure was not complete. Increasing heating time can broke tissue section, less heating time make background deep, Brdu was not good combination with first antibody, and the results were most negative. Hcl acid repair method: The background color of organization was shallow, Brdu staining contrasts with the background was remarkable, and can detect Brdu completely in the positions of the cells. ConclusionHcl acid for good critical nucleus DNA repair method of Brdu, antibodies into the nucleus, and easily color effect is obvious, and the operation is simple and easy, without heat source function at the same time. It has better security, and is an ideal method.

Key words：Brdu; IHC; Antigen retrieval