Foxp3及其调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌患者中表达的规律及对患者生存的影响

保鹏涛　赵卫国　冯金栋　刘宇　李芸　汤丽萍



Foxp3及其调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌患者中表达的规律及对患者生存的影响

保鹏涛赵卫国冯金栋刘宇李芸汤丽萍

100091 北京，中国人民解放军第309医院

【摘要】目的探讨Foxp3及其调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌患者中表达的规律及对患者生存的影响。方法Western-blot法检测正常肺组织、肺腺癌、鳞癌组织(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分层)中Foxp3水平。免疫组化方法观察小细胞肺癌、腺癌、鳞癌中Foxp3蛋白表达情况；流式细胞法检测临床各期肺腺癌患者和健康人群血清中表达Foxp3的CD4+CD25+Treg细胞计数，并观察化疗及手术对肺腺癌患者血清中Foxp3水平的影响。使用Kaplan-Meier生存曲线分析血清中CD4+CD25+Treg细胞计数与肺腺癌患者生存周期之间的关系。结果肺腺癌各期患者Foxp3表达水平和血清中CD4+CD25+Treg细胞计数均明显高于健康人群，与肿瘤分期呈正相关，经手术或化疗干预后患者外周血清中细胞计数下降明显。细胞计数低于平均值或化疗后细胞计数变化值高于平均值的患者平均生存周期明显高于细胞计数值高于平均值或化疗后细胞计数变化值小于平均值的患者。结论Foxp3调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌的发生发展中可能起着重要的作用，对其深入研究将有助于肺腺癌的早期诊断，并可将其作为常规检查及监测患者预后的指标之一。

【关键词】肺腺癌；Foxp3；CD4+CD25+Treg细胞；生存分析

肿瘤已经成为当今世界上对人类健康与生命危害最大的疾病，腺癌在所有肺癌患者中占近60%，其中女性肺腺癌和男性肺腺癌分别占其肺癌总数的86.2%和47.9%，因此如何寻找更为有效治疗肺癌特别是肺腺癌的方法成为目前研究的热点[1-2]。Foxp3又称叉状头/翅膀状螺旋转录因子，是一种转录抑制因子，研究发现其调控的CD4+CD25+Treg细胞在一些肿瘤患者血清中明显升高，其可能是肿瘤的发病机制之一，有相关报道在非小细胞肺癌患者血清中也发现类似现象[3]，但未见有深入研究报告，本研究旨在系统探讨Foxp3及其调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌患者中表达的规律以及化疗和手术对它们的影响，观察血清中CD4+CD25+Treg细胞计数与肺腺癌患者分期及生存预后之间的关系，为肺腺癌治疗提供新的思路。

材料和方法

一、实验材料

正常肺组织、肺腺癌和鳞癌组织(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分层)均来自我院中心实验室标本库。124例肺腺癌患者全部为2009年6月至2013年6月在我科住院经病理学(组织或细胞)诊断为肺腺癌的患者。Foxp3的Western-blot、免疫组化、流式细胞检测试剂盒购自上海生物科技有限公司。所有患者化疗方案均使用力比泰+卡铂方案进行化疗。

二、纳入/排除标准

纳入标准[4-5]：①有明确病理诊断的原发性肺腺癌首次治疗或接受既往治疗已结束2个月以上患者(肺癌组)；②心、肝、肾、造血、免疫系统功能基本正常；③年龄小于75岁，KPS评分在80分以上；④自愿参加本研究， 签署知情同意书，依从性好，可随访。

排除标准：①孕妇和精神病患者；②合并已经明确的可能导致CD4+CD25+调节性T 细胞水平变化的感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病等。

三、研究方法

1. 组织学Foxp3蛋白水平 ：免疫组化法分析比较小细胞肺癌和非小细胞肺癌组织中(腺癌和鳞癌)Foxp3的表达情况。Western-blot法分析比较正常肺组织20例，肺腺癌组织和鳞癌组织(按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa分期分层)各20例患者中Foxp3的水平表达情况。

2. 血清中CD4+CD25+Treg细胞计数：①肺腺癌各期患者(Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，ⅢA期20例，ⅢB期30例，Ⅳ期28例)及健康人群20例血清中CD4+CD25+Treg细胞计数；②肺腺癌患者(Ⅰ期22例，Ⅱ期24例)外科手术后及肺腺癌患者(ⅢB期30例，Ⅳ期28例)化疗2周期后血中白细胞恢复正常值且稳定3 d后血清中CD4+CD25+Treg细胞计数值。

3. 分析CD4+CD25+Treg细胞计数与肺腺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)生存周期之间的关系: 以肺腺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)血清CD4+CD25+Treg细胞计数平均值为界限，高于平均值的肺腺癌患者设为对照组，低于平均值的肺腺癌患者为空白组，分别随访记录两组患者生存时间，使用Kaplan-Meier生存曲线进行分析。按同样方法进一步分析经化疗后CD4+CD25+Treg细胞计数变化，比较高于平均值患者组与低于平均值患者组的生存曲线(排除年龄、分期、基础疾病等因素影响)。

4. 随访调查： 每月对所有患者进行电话随访1次，记录患者不良反应事件发生情况，生存情况直至患者去世或失访。

四、统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，均数资料使用t检验或方差分析。使用Kaplan-Meier生存曲线比较分析不同情况下肺腺癌患者的生存周期。

结　　果

一、一般情况

本研究共采集20名健康人群血清检测标本进行CD4+CD25+Treg细胞计数，其中女性12例，男性8例；平均年龄56.1岁；30岁～45岁3例，46岁～60岁12例，61岁～75岁3例；吸烟11例，不吸烟9例。

124例肺腺癌患者，其中Ⅰ期22例、Ⅱ期24例、ⅢA期20例、ⅢB期30例、Ⅳ期28例；女性66例，男性58例；平均年龄55.6岁；30岁～45岁25例，46岁～60岁81例，61岁～75岁18例；吸烟患者71例，不吸烟患者53例；本研究入院的Ⅰ期22例、Ⅱ期24例患者均进行了手术治疗，见表1。

表1　患者一般情况(n)

二、组织学Foxp3水平

免疫组化结果显示，在肺癌组织中Foxp3表达都要强于正常肺组织，非小细胞肺癌组织中Foxp3表达明显强于小细胞肺癌，进一步比较发现腺癌组织中Foxp3表达又强于鳞癌组织，见图1。

提取正常肺组织、肺腺癌组织及肺鳞癌组织中Foxp3蛋白，使用Western-blot法分析它们之间的差异，结果显示，与免疫组化结果相同，肺腺癌组织中Foxp3蛋白水平最高，明显高于正常肺组织及鳞癌组织(P<0.05)；进一步分析肺腺癌不同分期组织中Foxp3蛋白水平，结果显示分期越高肺腺癌组织中Foxp3蛋白水平也越高(P<0.05)，图2。

图1腺癌(不同分期)和鳞癌组织中Foxp3蛋白表达情况

三、血清中CD4+CD25+Treg细胞计数

流式细胞仪法检测血清中表达Foxp3的CD4+CD25+Treg细胞的比例，肺腺癌Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者显著高于健康人群和Ⅰ期患者(P<0.01)，肺腺癌Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者之间差异显著(P<0.01)，Ⅰ期患者和健康人群之间无显著差异(P>0.05)。手术前后改变值比较，Ⅰ期患者与Ⅱ期患者之间差异显著(P<0.05)，化疗前后改变值比较，ⅢB期患者与Ⅳ期患者之间无显著差异(P>0.05)，见表2、3，图3、4。

表2　肺腺癌患者及健康人群CD4+CD25+Treg细胞比例

表3　肺腺癌患者化疗/手术后CD4+CD25+Treg细胞比例变化情况

图2不同类型肺癌组织中Foxp3表达情况

图3腺癌(不同分期)CD4+CD25+Treg细胞计数

图4肺腺癌患者化疗/手术后CD4+CD25+Treg细胞计数变化

四、CD4+CD25+Treg细胞计数水平及化疗后变化与患者生存周期分析

根据前面所述方法，通过随访观察患者(ⅢB/Ⅳ期)生存时间，我们通过Kaplan-Meier生存曲线法绘制了不同CD4+CD25+Treg细胞计数水平及化疗后变化的情况和患者生存周期曲线，细胞计数水平高于平均值的32例患者平均生存周期为12.7±4.2月，细胞计数低于平均值的26例患者平均生存周期为16.9±3.7月(P<0.01)。经化疗后，细胞计数变化情况大于平均值的28例患者平均生存周期为16.4±4.5月，变化小于平均值的30例患者平均生存周期为13.5±3.6月(P<0.05)。我们进一步比较发现基数值低于平均值且化疗后细胞计数变化值高于平均值的13例患者平均生存周期为18.6±3.9月，远远高于基数值。高于平均值且化疗后细胞计数变化值小于平均值的16例患者平均生存周期为10.4±2.2月(P<0.05，表4，图5)。

表4　不同细胞计数水平及化疗后变化水平的患者生存时间(月)

图5不同CD4+CD25+Treg细胞计数及化疗后变化与患者生存曲线；注：A：细胞计数低于平均值；B细胞计数高于平均值；C：细胞计数减少值高于平均值；D细胞计数减少值低于平均值；E：细胞计数基数值低于平均值且化疗后变化值高于平均值；F细胞计数基础值高于平均值且化疗后变化值低于平均值

讨　　论

肺癌目前已经成为癌症的首要致死原因，其中肺腺癌无论在男性还是女性患者中都占有相当大比例。目前针对肺腺癌的主要治疗方案仍然是放化疗，虽然近几年来肺腺癌在靶向治疗方面取得了较大的进展，但是随着耐药的增加，寻找更有效的治疗手段或新的治疗靶点已经成为当前的研究热点[6-7]。正常情况下人体内的免疫稳态是由CD4+CD25+Treg 细胞维持的，它们能影响免疫系统对肿瘤抗原的应答，从而有效的免疫监视限制和清除肿瘤细胞。一些学者发现在非小细胞肺癌患者中该细胞的计数也明显升高，这为研究肺癌治疗提供了思路[8-10]。

本研究结果表明Foxp3无论是在鳞癌组织还是腺癌组织中表达水平都明显高于正常组织，进一步比较分析发现肺腺癌组织中Foxp3水平又明显高于鳞癌组织，而且肺腺癌患者血清中CD4+CD25+Treg细胞计数明显高于健康人群，且与肿瘤分期呈正相关。手术或化疗能可能是通过使肺腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞数量下降从而起到治疗作用。CD4+CD25+Treg细胞数增多、功能增强导致肿瘤免疫耐受的形成并降低了免疫系统对肺癌细胞的免疫应答，最终促进了肺癌的发生和发展，这可能是肺腺癌患者的发病机制之一[11-13]。研究发现CD4+CD25+Treg细胞是由Foxp3诱导发育的，能够特异性地表达Foxp3 ，其可以做为衡量人体中CD4+CD25+Treg细胞数量多少的一个重要指标[14-15]。本研究结果提示外周血中CD4+CD25+Treg细胞计数或Foxp3水平可作为肺腺癌诊断的一个非特异性指标之一。

生存分析结果显示肺腺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞计数与患者生存周期之间有相关性，二者关系密切，且明显呈负相关。而且经化疗后外周血中细胞计数变化不明显也意味着预后较差即生存周期较短。反之如果治疗措施能够有效的减少患者外周血清中CD4+CD25+Treg细胞计数，患者生存周期则明显改善。这提示可将患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞计数作为常规检查并作为预测患者预后的指标之一，以利于及时调整治疗方案及措施，达到改善患者预后的目的。

总之Foxp3调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌的发生发展中可能起着重要的作用，对其深入研究将有助于肺腺癌的早期诊断，可考虑将其作为常规检查及监测患者预后的指标之一，这也为肺腺癌患者治疗提供了新的思路。

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(本文编辑：王亚南)

保鹏涛，赵卫国，冯金栋，等. Foxp3及其调控的CD4+CD25+Treg细胞在肺腺癌患者中表达的规律及对患者生存的影响[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(3)： 301-305.

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.03.015

通讯作者：赵卫国，Email：zhaowg309@163.com

中图法分类号：R734.2

文献标识码：A

Corresponding author：Zhao WeiGuo, Email：zhaowg309@163.com

(收稿日期：2015-06-23)

Expression of Foxp3 and CD4+CD25+Treg cells in lung adenocarcinoma patients and the survival analysis of patients affected by them

BaoPengtao,ZhaoWeiguo,FengJindong,LiuYu,LiYun,TangLiping.ChinesePeople′sLiberationArmyNo309Hospital,Beijing100091,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the expression of Foxp3 and CD4+CD25+Treg cells in lung adenocarcinoma patients and the survival analysis of patients affected by them. MethodsWestern-blot was used to detect the levels of Foxp3 in normal lung tissues, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma (Ⅱ,Ⅰ,Ⅲa staging). Expression of Foxp3 protein in small cell lung cancer, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma was observed by immunohistochemistry. CD4+CD25+Treg cells counted by Flow cytometry method. Using Kaplan-Meier survival curves to analyze the relationship between serum CD4+CD25+Treg cells count and lung adenocarcinoma patients. Resultslung adenocarcinoma patients with Foxp3 expression level in serum and count of CD4+ CD25+ Treg cells were significantly higher than those in healthy people, was positively correlated with tumor stage, cell count decreased significantly after surgery or chemotherapy intervention in patients. Cell count lower than the average value or chemotherapy after cell counting change value higher than the average value of patients′mean survival time was more than that the cell count higher than average or chemotherapy after cell counting change value less than the average value of patients. ConclusionFoxp3 and regulatory CD4+CD25+Treg cells may be one of the pathogenesis of lung adenocarcinoma, CD4+CD25+Treg cell counts could be a routine examination and as a forecast index of prognosis for adenocarcinoma patients.

【Key words】Adenocarcinoma;Foxp3;CD4+CD25+Treg cells;Survival analysis