低频脉冲超声联合微泡对在体微小血管作用的实验研究

卫荆璐　余美玲　韦英丽　肖妮娜　柳建华

广州市第一人民医院超声医学科(广州 510180)



低频脉冲超声联合微泡对在体微小血管作用的实验研究

卫荆璐余美玲韦英丽肖妮娜柳建华

广州市第一人民医院超声医学科(广州 510180)

【摘要】目的探讨低频脉冲超声联合微泡对微血管的渗出作用。方法20只新西兰大白兔分为4组：空白组、单纯微泡组、单纯超声组、超声微泡组，进行实验观察。用频率为1 MHz，声压2000 MPa的脉冲超声辐照兔肠系膜及肠壁血管，在荧光显微镜下观察辐照前后肠系膜及肠壁上微血管的损伤，并静脉注入伊文思蓝溶液，观察超声辐照后对伊文思蓝溶液的渗出。结果空白组、单纯微泡组、单纯超声组在超声辐照后肠系膜及肠壁上微血管内血流通畅，注入伊文思蓝溶液后，微血管内呈蓝色染色，血管周围未见渗出；超声微泡组在超声辐照后微血管周围可见渗出，部分形成血肿。结论低频脉冲超声联合微泡对微小血管管壁产生损伤作用，血管周围可见渗出，部分形成血肿。

【关键词】超声治疗微泡肠系膜微血管渗出

超声联合微泡诱发血管损伤可以产生多种生物效应，低能量超声诱导微泡会产生血管内皮细胞损伤、内皮细胞间隙增宽、血管壁通透性增高、细胞死亡，红细胞溢出[1]，高能量超声诱导微泡会产生血管变形甚至破裂[2-3]、血管周围组织细胞水肿甚至变性、小血管内血栓形成[4]。

超声联合微泡诱发血管损伤在过去几年中被广泛研究，但机制研究较缺乏，多数在于离体细胞水平或者模拟血管，以细胞水平的研究为主。这几年随着摄像技术的发展，使用高速摄像显微镜观察单个微泡空化效应对内皮细胞膜的损伤，从而研究超声激励的微泡对细胞的作用机制，研究着重在稳态空化的作用，对于血管的是轻微的可逆的损伤作用。本文主要研究超声联合微泡在体肠系膜及肠壁微血管的损伤作用，更直观的观察低频高负值峰压超声诱导微泡对在体微血管壁的渗出作用。

1材料与方法

1.1超声治疗仪超声治疗仪是深圳市威尔德医疗电子有限公司提供，电源声压为AC100 V-240 V，波形具有连续和脉冲模式可选择。治疗超声换能器的直径约2.3 cm，由铝壳以及聚酰胺膜材质的接触面组成，通过声发生器与峰值电压发射器来驱动。本实验所选用的参数为非聚焦脉冲波，探头频率为1.0 MHz，声压2000 Kpa，脉冲重复频率为50 Hz，占空比为0.5%，脉冲持续时间9 s，间歇时间为3 s，治疗时间5 min。

1.2脂氟显微泡悬液脂氟显微泡悬液，由第三军医大学附属新桥医学超声科制作，为第二代造影剂。外观为乳白色的凝乳状，粒径平均值为2.13 μm，浓度为4～9×109/mL。本实验治疗所用的剂量为0.2 mL/kg，使用前需振动45 s。

1.3动物准备健康新西兰大白兔20只，质量约2.0～2.5 kg，由广东省医学实验动物中心提供。所有的实验过程均获得广州市第一人民医院伦理委员会的许可。所有实验大白兔术前禁食12 h，可自由饮水。实验用新西兰大白兔先使用速眠新Ⅱ注射液(由吉林省敦化市圣达动物药品有限公司生产)0.2 mL/kg进行肌肉注射，等待兔子初步麻醉后，使用21G针管插入实验兔左耳的耳缘静脉建立静脉通道，使用2.5%戊巴比妥钠(1.0 mL/kg)麻醉。室温保持在25 ℃左右，湿度在40%～60%之间，并且维持动物在深度麻醉下进行实验，实验兔仰卧位固定后，中下腹备皮，沿腹白线开腹，将部分小肠拉出体外，兔子侧卧位摆放，选择一段肠系膜血管进入肠壁分支较多的肠管(大约5 cm)固定，肠管内注入脱气水，固定后为辐照区域(见图1)。

图1　肠管注水后水浴治疗装置

1.4实验分组超声微泡组：抽取脂氟显微泡悬液0.2 mL/kg，加入生理盐水稀释至4 mL，5 min内经静脉通道缓慢匀速注入，同时用超声治疗仪辐照之前观察并标记的肠壁及肠系膜血管区域5 min。

单纯微泡组：超声治疗仪不发射能量，余同上，假照5 min。

单纯超声组：抽取脂氟显微泡悬液用4 mL生理盐水代替，经静脉注入，同时用超声治疗仪辐照之前观察并标记的肠壁及肠系膜血管区域5 min。

空白组：注入生理盐水，超声治疗仪不发射能量。

1.5观察方法使用显微镜(Olympus IX71倒置荧光显微镜——日本Olympus公司)观察治疗前血管形态，记录并将中心区域观察血管做标记；治疗结束后，使用显微镜再次观察标记血管，并记录。然后耳缘静脉注入伊文思蓝溶液(2%)5 mL，观察伊文思蓝在目标血管内的灌注情况，并记录。

1.6实验结束后，使用戊巴比妥钠10 mL/kg静脉推注进行过量麻醉安乐死，立即切取治疗中心的肠壁组织，置于10%福尔马林溶液固定1 d，经脱水、石蜡包埋及苏木素伊兰(HE)染色等程序后，连续切片制成病理切面，显微镜下进行病理学观察。

2结果

治疗后显微镜上观察可以看到空白组、单纯微泡组、单纯超声组微血管形态正常未见损伤，微血管内血流通畅，血管周围未见渗出，见图2。超声微泡组在显微镜下观察到治疗前血流通畅，治疗后血流流速减慢，微血管周围可见渗出，部分渗出形成血肿，血肿形态可分为三种，一为沿着血管分布的血肿，呈条状，边界清晰，分布规则；二为大片血肿渗出，呈云絮状，这种血肿在显微镜一个视野下通常看不到边界，分布无规则，在血管旁或者覆盖血管；三为血管末端以及分支处的小血肿，呈类圆形。

图2　a图为空白组血管治疗后，未见明显改变。

注入伊文思蓝溶液后，空白组、单纯微泡组、单纯超声组治疗区域内微血管迅速呈蓝色染色，血管外未见蓝色渗出；超声治疗组治疗区域内微血管蓝色染色速度较慢，微血管周围可见蓝色渗出，渗出血肿呈蓝色。

病理片显微镜观察发现：空白组、单纯微泡组、单纯超声组微血管管壁平整，血管周围未见红细胞渗出，部分血管内可见少量红细胞堆积，肠壁组织结构规则，组织间隙未见红细胞堆积。超声微泡组血管中可见大片红细胞出现在肠壁组织边缘，以及血管周围可见红细胞渗出。

3讨论

超声联合微泡作用于血管壁使其通透性增高，冲击波和微射流产生的机械应力可在细胞膜上穿孔甚至穿透血管[5]。这可能是造成了对血管的直接损伤作用，使血管壁渗透性增高，红细胞渗出，在血管周围成血肿。本研究由于肠系膜及肠壁血管内动静脉血管相伴行，内径也较为接近，但是在治疗后，血管的渗出多发生在微静脉，这可能与其血管壁结构有关，微静脉血管管壁薄且无平滑肌或者弹性膜。

肠系膜及肠壁微小血管管壁损伤后渗出血肿对微血管无明显阻断作用，这可能是由于在肠壁组织较为疏松，血肿向外周扩散，对血管的挤压作用不强，而若在实质性脏器中，如肝、脾，由于血管周围组织致密，血肿形成会挤压血管以及肝窦、脾窦结构，对微小血管产生阻断作用，对大、中血管则阻断作用不明显，随着血肿的逐渐消退，血管可能会再通[6]。

从本实验结果可以表明，超声激励微泡对微血管可以造成一定程度的损伤，血液渗出后形成血肿。部分大血肿在实质性脏器中可能会对附近血管有一定的挤压作用，同时联合组织水肿以及血管内血栓形成共同阻断血管。有研究证明[7]，在30 min或60 min后，实质性脏器会有部分再灌注现象，阻断效应随时间的延长逐渐减轻、消失。这个血流的再灌注机制尚不明确，在本实验中我们得出大部分微血管在损伤后会出现血肿，由于肠壁组织松散，血肿的形成不容易对血管造成挤压，但是在实质性脏器中，组织结构紧密，血管损伤后产生的血肿易对血管以及肝、脾血窦造成挤压，但是血肿是新形成不稳定的结构，随着时间的推移，血肿可能会消退，血肿对血管的挤压效果消失，可能会有部分大、中血管再通。在本实验中，我们没有观察血流的再灌注，以及血肿的消退，希望在未来的实验中我们可以进一步研究再灌注的机制，从而进一步了解超声激励微泡对血管损伤及阻断的机制，对超声治疗走向临床奠定坚实的实验基础。

参考文献：

[1] LI Y, WANG J, WIENEJES MG,et al. Delivery of nanomedicines to extracellular and intracellular compartments of a solid tumor[J]. Adv Drug Deliv Rev，2012,64(1): 29-39.

[2] CHEN H，BRAYMAN AA,BAILEY MR, et al. Blood vessel rupture by cavitation[J]. Urol Res, 2010,38(4):321-326.

[3] FANG J, NAKKAMURA H, MAEDA H. The EPR effect: Unique features of tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2011,63(3): 136-151.

[4] 皋月娟,刘政,赵宝珍,等.超声击破造影剂微泡阻断肝正常血流灌注的造影观察[J]. 中国超声影像学杂志，2010，19 (7):614- 616.

[5] PARK D, PARK H, SEO J, et al. Sonophoresis in transdermal drug deliverys[J]. Ultrasonics, 2014,54(1): 56- 65.

[6] GAO Y, GAO S, ZHAO B, et al. Vascular effects of microbubble-enhanced, pulsed, focused ultrasound on liver blood perfusion[J]. Ultrasound Med Biol，2012,38(1): 91-98.

[7] FENG G,LIU J,ZHAO X,et al. Hemostatic effects of microbubble-enhanced low-intensity ultrasound in a liver avulsion injury model[J]. PLoS One，2014,9(5): e95589.

基金项目：广东省自然科学基金面上项目(S2013010016277)；广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020212014)

通信作者：柳建华，E-mai：liujianhua666666@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.029

(收稿日期：2015-11-27)