ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻的保护作用

孙明立，赵海山，姚维范，魏敏杰

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

·短篇论著·

ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻的保护作用

孙明立，赵海山，姚维范，魏敏杰

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

目的探讨ω⁃6大豆油脂肪乳对番泻叶导致的小鼠腹泻的保护作用。方法将36只昆明小鼠随机分为对照组、腹泻组和ω⁃6大豆油脂肪乳组，每组12只。利用番泻叶制备小鼠腹泻模型。造模后，ω⁃6大豆油脂肪乳组注射ω⁃6大豆油脂肪乳（15 mL/kg，每日1次），对照组与腹泻组小鼠每日尾静脉注射等剂量生理盐水，连续给药10 d。自造模之日起动态观察小鼠一般状态并记录小鼠体质量；并于给药前及给药第1、4、7和10天分别计算小鼠腹泻指数；给药10 d后处死小鼠，采用HE染色法观察小鼠小肠黏膜形态学变化；采用生化法检测小鼠血浆白蛋白（ALB）水平；采用免疫组化检测小鼠小肠黏膜组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果与腹泻组相比，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠的一般状况和体质量明显改善，小鼠腹泻指数明显降低；给药10 d后，与腹泻组相比，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠小肠黏膜损伤明显改善、血浆ALB水平显著升高，小肠黏膜中PCNA表达显著升高（P＜0.05）。结论ω⁃6大豆油脂肪乳对番泻叶所致的小鼠腹泻具有显著的保护作用，其机制可能与上调PCNA表达水平有关。

ω⁃6大豆油脂肪乳；番泻叶；腹泻；小肠黏膜损伤

网络出版地址

腹泻是多因素引起的肠道疾病，是肠道在感染或非感染因素刺激下，肠黏膜出现发炎、水肿，肠分泌及运动功能亢进，出现稀便和便频等症状。腹泻持续可导致肠黏膜损伤、全身营养不良等。近年来腹泻发病率上升，严重影响人的身体健康，因此开发用于预防和控制腹泻的有效方法日益迫切。ω⁃6大豆油脂肪乳富含亚麻酸、亚油酸等必须脂肪酸，是肠外为机体提供必需脂肪酸和能量的营养成分之一，对于人体必需脂肪酸缺乏症具有预防和治疗的作用［1］。近来研究表明，胃肠黏膜内必需脂肪酸可快速转化成前列腺素E，进而促进胃肠黏膜损伤

网络出版时间：修复［2］。此外，我们的前期研究［3］表明，必需脂肪酸的摄入可通过提高体内的抗氧化应激能力促进胃黏膜损伤的修复。因此，提高饮食中亚油酸等必需脂肪酸的摄入量将对胃肠损伤后的修复具有重要作用。ω⁃6大豆油脂肪乳是否可促进腹泻肠黏膜修复，进而改善腹泻症状，目前尚未见报道。本研究以番泻叶诱导的小鼠腹泻模型为研究对象，探讨ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻是否具有保护作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1　　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物：10周龄清洁级昆明小鼠36只，雌雄各半，体质量20～24 g，由中国医科大学试验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2003⁃0009，实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2003⁃0013。清洁环境下进行饲养及实验操作，实验动物不限食水，每笼6只。实验室温度20～25℃，相对湿度40%～70%，执行标准为《中华人民共和国国家标准实验动物环境及设施GB14925⁃2001》。

1.1.2药品与试剂：英脱利匹特（华瑞制药有限公司，500 mL含50 g大豆油、6 g卵磷脂），白蛋白（albu⁃min，ALB）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear anti⁃gen，PCNA）抗体（北京博奥森生物技术有限公司），番泻叶药材（沈阳维康大药房）。

1.1.3仪器：分析天平LA⁃204（常熟市百灵天平仪器有限公司），切片机KD⁃2508（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），石蜡包埋机LS⁃100、摊片机LS⁃80、烘片机LS⁃90（沈阳市龙首电子仪器有限公司），Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Scientific公司），80i高级研究型显微镜（日本Nikon公司）。

1.2方法

1.2.1实验分组及药物处理：按照体质量将小鼠随机分为对照组、腹泻模型组、ω⁃6大豆油脂肪乳组，每组12只。腹泻组和ω⁃6大豆油脂肪乳组每日0.3 g/mL的番泻叶（生药）0.5 mL灌胃，连续灌胃15 d，对照组同步等体积生理盐水灌胃。造模第6日起，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠每日尾静脉缓慢注射15 mL/kg英脱利匹特，连续给药10 d，对照组和腹泻模型组小鼠每日尾静脉注射等体积生理盐水。

1.2.2一般状况及体质量动态观察：动态监测小鼠体质量，描记生长曲线，观察小鼠的饮食、精神、体温、皮毛、鼻唇、眼睛、尾部、粪便等一般状态变化。

1.2.3ALB水平测定：末次给药后4 h，取小鼠外周血，生化法测定血中ALB水平，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.4腹泻指数检测：小鼠予单笼饲养，笼底垫滤纸和铁丝网，在给药前1 d及治疗后第1、4、7、10天于给药后开始计时，观察5 h内腹泻情况，通过计算腹泻指数反映腹泻情况。腹泻指数=稀便率×平均稀便级。稀便率：每只动物排稀便数与总便数之比。稀便级：表示每只动物稀便的程度，以稀便污染滤纸的直径定级。分为4级：1级，＜1 cm；2级，1～1.9 cm；3级，2～3 cm；4级，＞3 cm。平均稀便级=所有稀便级数相加/稀便次数。

1.2.5肠黏膜形态学检测：末次给药后6 h，剖腹，取十二指肠韧带远端5 cm处小肠5 cm，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色。

1.2.6PCNA表达检测：末次给药后6 h，取小肠标本，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。免疫组化SP法检测PCNA表达。石蜡组织切片经二甲苯脱蜡，降梯度乙醇脱苯、水化。将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），80 kPa高压修复10 min。切片经3%过氧化氢/甲醇及10%非免疫性正常山羊血清处理后，滴加鼠抗人PCNA单克隆抗体（1∶100，北京博奥森生物技术有限公司），4℃孵育过夜。次日切片先后经生物素标记的二抗（1∶200）和链霉菌抗生物素蛋白辣根过氧化酶复合物孵育，然后滴加新鲜配制的DAB溶液显色。最后，切片经苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后观察。同步操作阴性对照，采用PBS代替PCNA抗体，其他步骤不变。结果判定：阳性细胞以细胞核内出现棕褐色颗粒为准，阳性细胞最密集处任选5个非重叠视野，高倍镜（×40）下计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。

1.3统计学分析

数据采用SPSS 16.0统计分析软件进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student⁃Newman⁃Keuls法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　　结果

2.1ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠一般状况及体质量的影响

造模后小鼠神态萎靡，食少纳呆，被毛散乱而无光泽，腹泻症状明显，腹泻严重时甚至有脱肛，分笼前易聚堆，单笼饲养后喜蜷缩一角，少动，体质量呈下降趋势。ω⁃6大豆油脂肪乳处理后，小鼠腹泻症状明显减轻，精神状态明显好转，饮食及活动明显增加，体质量于给药后第4、7及10天有所改善，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　　各处理组小鼠体质量、腹泻指数、ALB水平及PCNA阳性表达率的变化（±s）Tab.1　Effect of soybean oil fat emulsion on body weight，diarrhea index，ALB level and positive rate of PCNA in mice（±s）

表1　　各处理组小鼠体质量、腹泻指数、ALB水平及PCNA阳性表达率的变化（±s）Tab.1　Effect of soybean oil fat emulsion on body weight，diarrhea index，ALB level and positive rate of PCNA in mice（±s）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs diarrhea group.

Item　Control group　Diarrhea group　　ω⁃6 soybean oil fat emulsion group Body weight（g）Before modeling　22.21±1.27　22.47±1.04　21.75±1.12 4 d after modeling　22.66±1.07　20.59±1.241）　20.33±1.11 1 d after administration　22.83±1.11　20.17±1.161）　20.00±1.36 4 d after administration　22.95±1.17　18.60±0.941）　19.67±1.50 7 d after administration　24.53±1.59　17.56±1.291）　19.00±1.49 10 d after administration　24.94±0.83　17.13±0.671）　18.20±0.87 Diarrhea index Before modeling　-　1.87±0.50　1.86±0.53 1 d after administration　-　1.99±0.54　1.23±0.442）4 d after administration　-　1.81±0.54　0.84±0.412）7 d after administration　-　1.76±0.70　0.78±0.452）10 d after administration　-　1.71±0.64　0.83±0.412）ALB level（g/L）　16.92±2.19　13.50±1.601）　17.20±2.152）Positive rate of PCNA（%）　10.06±2.56　8.99±3.05　21.98±2.892）

2.2ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠血浆ALB水平的影响

与对照组相比，腹泻组小鼠血浆ALB水平显著降低（P＜0.05）；与腹泻组相比，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠血浆ALB水平显著增加（P＜0.05），见表1。

2.3ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻指数的影响

腹泻组小鼠腹泻指数随时间推移呈先升高后下降的趋势，各时间点腹泻指数均＞1.5。与腹泻组小鼠相比，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠给药后各时间点腹泻指数均显著降低（P＜0.05），见表1。

2.4ω⁃6大豆油脂肪乳对腹泻小鼠肠黏膜损伤的影响

对照组小鼠小肠肠壁各层结构清晰，黏膜上皮形成绒毛突向肠腔。腹泻组小鼠小肠黏膜变薄，绒毛高度及表面积减少。ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠小肠上皮及绒毛不同程度恢复。见图1。

2.5ω⁃6大豆油脂肪乳对腹泻小鼠肠黏膜PCNA表达的影响

图1　　各处理组小鼠小肠黏膜组织病理学改变 HE×100Fig.1　The pathological changes of intestine mucosa in each group HE×100

PCNA阳性细胞主要分布于肠隐窝区。腹泻组和对照组小鼠肠隐窝区PCNA阳性表达细胞较少。ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠肠隐窝区可见阳性表达细胞显著增多（P＜0.05）。见图2，表1。

图2 各处理组小鼠小肠黏膜组织PCNA表达 HE×400Fig.2　The PCNA expression in intestine mucosa in each group HE×400

3　　讨论

成功建立动物模型是评价抗腹泻药物疗效的前提。本研究中利用番泻叶制备小鼠腹泻模型，造模后小鼠出现排便次数增多，粪便稀薄如糊状，甚至稀如水样等典型的腹泻症状，同时出现体质量降低等营养缺乏表现，造模成功率达100%。此外，该方法具有操作简单、设备简易、周期短等优点，因此该模型适用于本研究。

为探讨ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻是否具有保护作用，本研究首先观察了ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠腹泻指数及小肠病理学的影响。结果发现，与腹泻组比较，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠腹泻指数明显降低，小肠黏膜损伤病理学变化缓解。同时我们观察了ω⁃6大豆油脂肪乳对腹泻小鼠营养状况的影响，包括一般状态、体质量及血浆ALB含量。结果发现，与腹泻组比较，ω⁃6大豆油脂肪乳组小鼠一般状态改善、体质量增加，同时血浆ALB含量增加。以上提示，ω⁃6大豆油脂肪乳对小鼠实验性腹泻具有较好的保护作用。

PCNA是一种核蛋白，是DNA合成酶的辅助蛋白，为细胞合成DNA所必需，几乎在所有处于增殖状态的细胞核均有表达。PCNA阳性表达的强弱直接反映了细胞增殖活动的高低，是评价细胞增殖状态的良好指标［4⁃6］。近来研究［7⁃8］表明，PCNA参与肠黏膜损伤后细胞增殖修复，是评价抗腹泻药物疗效的常用指标。有研究［9］报道，ω⁃6不饱和脂肪酸可促进肠组织PCNA表达，进而促进结肠癌的发生发展，但关于ω⁃6不饱和脂肪酸是否可促进PCNA表达进而促进小肠黏膜损伤修复，目前未见报道。因此，为探讨ω⁃6大豆油脂肪乳促进腹泻恢复的作用机制，我们考察了ω⁃6大豆油脂肪乳对腹泻小鼠小肠组织中PCNA表达水平的影响，结果发现ω⁃6大豆油脂肪乳可显著增加PCNA表达水平，提示ω⁃6大豆油脂肪乳可能通过增加PCNA表达、促进肠黏膜细胞DNA合成，促进肠黏膜损伤后细胞增殖修复。

综上所述，ω⁃6大豆油脂肪乳可能通过促进腹泻小鼠肠黏膜中PCNA表达，进而促进小鼠腹泻的恢复，但确切的机制仍需进一步研究。

［1］段叶辉，李凤娜，李丽立，等.n⁃6/n⁃3多不饱和脂肪酸比例对机体生理功能的调节［J］.天然产物研究与开发，2014，26（4）：626-631.

［2］白雪，李世拥，于波，等.橄榄油脂肪乳在老年胃肠手术患者肠外营养治疗中的应用［J］.中华普外科手术学杂志，2014，8（3）：251-255.DOI：10.3877/cma.j.issn.1674⁃3946.2014.03.073.

［3］何林秀，孙明立，边竞，等.ω⁃3鱼油脂肪乳对环磷酰胺所致小鼠胃黏膜损伤的保护作用［J］.中国医科大学学报，2015，44（12）：1090-1093.DOI：10.3969/j.issn.0258⁃4646.2015.12.009.

［4］VASCONCELOS PC，SEITO LN，DI STASI LC，et al.Epicatechin used in the treatment of intestinal inflammatory disease：an analysis by experimental models［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：508902.DOI：10.1155/2012/508902.

［5］DEZFULI BS，GIARI L，LUI A，et al.Proliferative cell nuclear anti⁃gen（PCNA）expression in the intestine of Salmo trutta trutta natu⁃rally infected with an acanthocephalan［J］.Parasit Vectors，2012，5 （1）：198.DOI：10.1186/1756⁃3305⁃5⁃198

［6］LEE MY，ZHANG S，LIN SH，et al.Regulation of human DNA poly⁃merase delta in the cellular responses to DNA damage［J］.Environ Mol Mutagen，2012，53（9）：683-698.DOI：10.1002/em.21743.

［7］吴琼，叶华，朱宇珍，等.黄芩汤预防伊立替康所致迟发性腹泻的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（12）：163-168.

［8］赵秀军，李艳丽，赵昱，等.复方双苓止泻散对腹泻模型大鼠小肠黏膜PCNA mRNA表达的影响［J］.时珍国医国药，2010，21（11）：2876-2877.DOI：10.3969/j.issn.1008⁃0805.2010.11.074.

［9］陈小良，李建忠，曾利娴，等.ω⁃6不饱和脂肪酸促进结肠癌变的实验研究［J］.中华胃肠外科杂志，2010，13（10）：774-777.DOI：10.3760/cma.j.issn.1671⁃0274.2010.10.016.

（编辑陈姜）

Protective Effect of ω⁃6 Soybean Oil Fat Emulsion on Folium Sennae⁃induced Diarrhea in Mice

SUN Mingli，ZHAO Haishan，YAO Weifan，WEI Minjie
（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of ω⁃6 soybean oil fat emulsion on folium sennae⁃induced diarrhea in mice.Methods Thirty⁃six Kunming mice were randomly divided into three groups，including control，diarrhea，ω⁃6 soybean oil fat emulsion group（12 mice in each group）.Besides the mice in control group，other mice were administrated folium sennae by gavage for 15 days to establish the diarrhea model. Then mice in ω⁃6 soybean oil fat emulsion group received ω⁃6 soybean oil fat emulsion by intravenously administration at a dose of 15 mL/kg daily since 6th day after intragastric administration of folium sennae for 10 days.Animals in control group and diarrhea group were intravenously adminis⁃tered with same volume of saline.The body weight，general state and diarrhea index of the mice in each group were dynamically assessed.Ten days after intravenous injection，mice in every group were sacrificed and tissues were collected.Morphology of intestine mucosa was observed after HE staining.Albumin（ALB）level in plasma was evaluated by biochemical method.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in intestine mucosa were assessed by immunohistochemical method.ResultsCompared with that in the diarrhea group，the general status，body weight and diarrhea index of mice in ω⁃6 soybean oil fat emulsion group were improved significantly.Ten days after intravenously administration，pathological change in intestine mucosa of mice in ω⁃6 soybean oil fat emulsion group was improved significantly，ALB level in plasma and PCNA expression in intestine mucosa were significantly increased（P＜0.05）compared with that in diarrhea group.Conclusionω⁃6 soybean oil fat emulsion has a significant protective effect on the diarrhea of mice induced by folium sennae，which may be related to the up⁃regulated expression of PCNA by ω⁃6 soybean oil fat emulsion.

ω⁃6 soybean oil fat emulsion；folium sennae；diarrhea；intestinal mucosal injury

R965.1

A

0258-4646（2016）08-0742-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.08.017

孙明立（1980-），男，讲师，博士.

魏敏杰，E-mail：weiminjie1963@163.com

2015-12-09