尼卡地平对家兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响

韩露，张继倬，陈兴华

（首都医科大学附属北京世纪坛医院心外科，北京 100038）

尼卡地平对家兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响

韩露，张继倬，陈兴华

（首都医科大学附属北京世纪坛医院心外科，北京 100038）

目的探讨尼卡地平对家兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响。方法40只新西兰家兔随机分为4组，对照组（A组）、缺血组（B组）、再灌注组（C组）、尼卡地平组（D组）。通过结扎冠状动脉左侧旋支40 min，开放120 min建立缺血再灌注模型。采用磷脂酰丝氨酸外翻分析方法（Annexin V法）检测家兔心肌凋亡情况。结果病理切片提示D组心肌细胞受损情况明显低于B组和C组（P＜0.01）。D组心肌细胞凋亡明显少于B组及C组（均P＜0.01），但高于A组（P＜0.05）；D组心肌细胞坏死少于B组及C组（均P＜0.01），与A组比较无统计学差异（P＞0.05）。结论尼卡地平可以减少家兔缺血再灌注损伤所诱导的心肌细胞凋亡。

凋亡；尼卡地平；缺血再灌注；心肌细胞；Annexin V

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冠状动脉粥样硬化性心脏病是影响人类健康的杀手之一，因病情严重需要行冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）的患者越来越多，很多患者因为高龄，冠状动脉病变严重，在手术麻醉诱导的时候会出现高血压危象（特别是高血压病Ⅲ级），导致心肌耗氧增加，从而发生急性心肌梗死等并发症；另外心脏旁路移植手术能导致心脏缺血再灌注损伤，这些均是患者围手术死亡的重要原因［1］。大量实验及临床观察［2］表明心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中起关键性的作用。尼卡地平注射液是第二代二氢吡啶类钙离子拮抗剂，其静脉制剂已经广泛用于治疗原发性高血压和围术期高血压［3］。尼卡地平能否在术前起到心肌缺血预适应，术中、术后能否减轻患者的缺血再灌注损伤还不清楚。本实验探讨尼卡地平对家兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响。

1　　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器

新西兰家兔40只［兴隆实验动物养殖厂，许可证SYXK（京）2011⁃0018普通级］。主要试剂包括尼卡地平［安斯泰来制药（中国）有限公司］、Annexin V（磷脂酰丝氨酸外翻分析）细胞凋亡试剂盒、PBS液、胰酶消化液（北京四正佰生物科技有限公司）。主要仪器有小动物呼吸机、动物监测仪、流式细胞仪等。

1.2方法

1.2.1分组：随机均分为4组，对照组（A组），仅穿线，不阻断，160 min后直接取心肌标本；缺血组（B组），穿线后阻断，160 min后取心肌标本；再灌注组（C组），穿线后阻断缺血40 min，开放再灌注120 min后取心肌标本；尼卡地平组（D组），手术开始前30min于家兔耳缘静脉全程泵入尼卡地平［0.2 μg/（kg·min）］，穿线后阻断缺血40 min，再灌注120 min后取心肌标本。

1.2.2手术方法：所有家兔均经耳缘静脉注射20%乌拉坦注射液（1 g/kg）及10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉成功后，剪出颈部及胸部兔毛，经口给予气管插管（如家兔呼吸欠佳，给予小动物呼吸机辅助呼吸），取胸骨旁切口总切口，至剑突处约10 cm切口，游离剑突上3个肋骨，靠胸骨侧剪断剑突向上第二、三肋骨，游离相关组织，小型牵张器牵开，剪开纵行剪开心包（注意小心勿损伤胸膜）于左心耳下，心脏旋支起始处缝1针套环后收紧结扎。

1.2.3心肌细胞检测：家兔安乐死后取左心耳结扎处下方心肌，用10%甲醛固定保存，做HE染色，切片，显微镜观察心肌梗死病变情况。手术结束后根据分组情况取左心耳结扎处下方心肌（约5 g），PBS液保存。1 h内将标本经小剪刀剪碎，经PBS液冲洗3次，离心机离心去上清，0.25%的胰酶消化1 h，离心机离心取上清，加入100 μL结合缓冲液和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的Annexin V（20 μg/mL）10 μL，室温避光30 min，再加入碘化丙锭（50 μg/mL）5 μL，避光反应5 min后，加入400 μL结合缓冲液，立即用Facscan进行流式细胞术检测（一般不超过1 h），同时以不加Annexin V FITC及PI的一管作为阴性对照。

1.3统计学分析

2　　结果

2.1各组心肌细胞染色结果比较

结果显示，A组心肌可见肌纤维呈束状排列，细胞染色正常，细胞核排列基本规则；B组心肌可见失去正常肌纤维结构，细胞染色异常，水肿明显，细胞核固缩；C组可见正常肌纤维结构消失，细胞染色异常，细胞水肿，细胞核排列不规则；D组可见间质水肿轻，细胞染色基本正常，肌纤维排列基本正常。见图1。

图1　　各组心肌细胞染色结果比较 ×200Fig.1　Comparison of staining results of myocardial cells in each group×200

2.2各组心肌凋亡结果比较

结果显示，D组心肌细胞的凋亡程度低于B组和C组（P分别为0.000 4，0.000 3，），高于A组（P= 0.034 3）。心肌细胞的坏死程度D组低于B组和C组（P分别为0.000 2，0.003 8，），但与对照组比较无统计学差异（P=0.106 3，）。见图2、表1。

图2　　流式细胞仪检测各组细胞凋亡及坏死结果Fig.2　Flow cytometry instrument testing each cell apoptosis and necrosis

表1　　各组细胞凋亡及坏死情况比较（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

表1　　各组细胞凋亡及坏死情况比较（±s，%）Tab.1　Cell apoptosis and necrosis in each group（±s，%）

1）P＜0.05 vs groups A，B，and C；2）P＜0.01 vs groups B and C.

Group　n　Apoptosis　Necrosis n Percentage（%）　n　Percentage（%）A 10　1 981±1 325　22.00±2.94　202±111　2.99±0.48 B 10　12 713±3 937　28.64±2.67　3 243±1 174　18.64±3.88 C 10　13 676±3 404　34.15±9.18　3 181±2 339　11.41±2.88 D 10　3 599±1 639　22.39±3.441）　295±63　3.64±0.882）

3　　讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病患者很多需要行冠状动脉旁路移植术，很多高龄患者冠状动脉病变严重，术前有高血压病史，在手术麻醉诱导的时候会出现高血压危象，导致心肌耗氧增加而发生心肌缺血，甚至出现急性心肌梗死等并发症，导致术中及术后循环不稳，心肌酶升高等情况，从而危及患者生命。尼卡地平是术前患者用来降压的药物，除了降压作用外是否还有其他改善心肌缺血的作用既往的文献没有报道［4］。本实验结果显示，D组心肌细胞的凋亡及坏死程度低于B组和C组（P＜0.01），可见尼卡地平可以减轻心肌细胞凋亡，减少心肌细胞坏死。说明术前应用尼卡地平对心肌进行缺血预适应有一定作用，一定程度上能改善心肌缺血及再灌注损伤，从而改善心脏功能。虽然在细胞凋亡D组高于A组（P＜0.01），但在心肌坏死方面2者却无统计学差异（P＞0.05），说明尼卡地平缺血预适应后无太多坏死心肌，与以往研究［5］结果一致。

尼卡地平是一种新型L型钙离子拮抗剂，能抑制心肌与血管平滑肌的跨膜钙离子内流而不改变血钙浓度，血管选择性较强，在血管平滑肌作用胜于心肌。动物实验中选择性扩张冠状血管平滑肌，此作用产生时的血药浓度对心肌不产生负性肌力作用，对心律及心收缩力的影响极小。因而能改善冠状动脉供血，减少心肌耗氧。研究［6-7］显示尼卡地平分布于缺血的细胞膜，可以改善组织灌注及代谢紊乱，抑制细胞钙内流，减轻线粒体钙超载，恢复三磷酸腺苷生成，减轻细胞内乳酸中毒，降低细胞内pH，从而改善心肌缺氧状态，减少心肌凋亡的发生。通过动物实验［8］证明尼卡地平在急性心力衰竭患者中可增加心脏指数、降低全身外周血管阻力，降低肺动脉楔压，但对心率无影响。因而对心肌凋亡及坏死有一定的抑制作用。

综上所述，尼卡地平对心肌缺血及再灌注损伤有缺血预适应作用，可以减少缺血再灌注损伤所诱导的心肌细胞凋亡及坏死。在选择围手术期降压药物方面，尼卡地平更有优势，今后应进一步研究冠脉桥内给予小剂量尼卡地平是否能进一步抑制心肌凋亡及坏死。

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［3］黄正明.尼卡地平抗高血压的药理研究［J］.国外医学：药学分册，2001，28（12）：110.DOI：10.13220/j.cnki.jipr.1991.02.018.

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［8］谢云燕，秦俭.乌拉地尔和尼卡地平静脉用药对老年高血压急症患者儿茶酚胺的影响［J］.心肺血管病杂志，2014，33（4）：521-524.DOI：10.3969/j.issn.1007-5062.2014.04.014.

（编辑武玉欣）

EffectsofNicardipineonApoptosisinIschemiaReperfusionMyocardiumofRabbits

HANLu，ZHANGJizhuo，CHENXinghua
（DepartmentofCardiacSurgery，BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100038，China）

ObjectiveTo investigate the effects of nicardipine on apoptosis in ischemia⁃reperfusion myocardium of rabbits.MethodsForty New Zealandrabbitwererandomlydividedinto4groups：controlgroup（group A），ischemiagroup（group B），ischemia⁃reperfusiongroup（group C），ni⁃cardipine treatment group（group D）.Ischemia⁃reperfusion model was established by left circumflex branch coronary artery ligation for 40 min，fol⁃lowedby120minreperfusion.Apoptoticcardiomyocytewasdetectedusingtheanalysisfortheexposureofphosphatidyl⁃serine（AnnexinV）meth⁃od.ResultsMyocardial celldamage waslower inDgroupthanthatingroupBandgroupCfrompathology（P＜0.01）.Themyocardial cellapopto⁃sis in group D is less than that of group B and group C（P＜0.01），but higher than that of group A（P＜0.05）.Myocardial cell necrosis is lower than group B and group C（P＜0.01），and no difference was found comparing with group A（P＞0.05）.ConclusionNicardipine horizon can reduce themyocardialcellapoptosisinrabbitswithmyocardialischemicreperfusioninjury.

apoptosis；nicardipine；ischemia⁃reperfusion；cardiomyocyte；anexin V

R654.2

A

0258-4646（2016）08-0746-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.08.018

韩露（1978-），男，主治医师，博士. E-mail：moer031@163.com

2015-06-18
网络出版时间：