散发性乳腺癌中Ezrin和β⁃catenin蛋白表达的相关性和临床意义

赵琳，于兆进，何苗，孙明立，魏敏杰

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

·论著·

散发性乳腺癌中Ezrin和β⁃catenin蛋白表达的相关性和临床意义

赵琳，于兆进，何苗，孙明立，魏敏杰

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

目的埃兹蛋白（Ezrin）和β⁃连环蛋白（β⁃catenin）的作用与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关，本研究旨在探讨二者在乳腺癌中的临床意义。方法 应用免疫组织化学染色法检测145例乳腺癌病理组织中Ezrin和β⁃catenin蛋白的表达水平，并分析二者相关性及其与乳腺癌临床资料和预后资料的相关性。结果145例散发性乳腺癌组织中Ezrin阳性表达70例（48.3%），β⁃catenin阳性表达82例（56.6%），二者呈显著负相关（r=-0.267，P=0.001）。乳腺癌组织学分级增高，Ezrin表达水平显著升高（P=0.007），β⁃catenin表达水平显著降低（P＜0.001）。发生淋巴结转移的乳腺癌组织Ezrin表达水平显著升高（P=0.027），β⁃catenin表达水平显著降低（P=0.011）。Ezrin蛋白表达与乳腺癌患者总体生存期（P=0.004）及无病生存期（P=0.017）缩短显著相关，β⁃catenin阳性表达则可显著延长患者总体生存期（P＜0.001）及无病生存期（P=0.001）。但多变量Cox回归发现，Ezrin 与β⁃catenin并非影响乳腺癌患者生存期的独立风险因素。结论乳腺癌中Ezrin和β⁃catenin显著负相关，且在乳腺癌转移、恶化等病程进展及不良预后过程中发挥一定作用，可作为乳腺癌治疗靶点。

乳腺癌；埃兹蛋白；β⁃连环蛋白；转移；预后

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恶性肿瘤的侵袭转移是造成其复发和不良预后的重要因素，因此对女性最常见的恶性肿瘤乳腺癌的侵袭转移机制进行深入研究具有重要意义。埃兹蛋白（Ezrin）是膜-细胞骨架连接蛋白家族成员之一，在细胞的有丝分裂、增殖及细胞黏附、迁移等生物学行为中发挥重要作用［1⁃2］。在诸多肿瘤研究［3⁃4］中发现，Ezrin与肿瘤的侵袭转移及不良预后有密切关系。β⁃连环蛋白（β⁃catenin）主要具有细胞间黏附连接功能，参与包括Wnt信号转导通路在内的多种细胞信号转导途径，其功能异常与肿瘤侵袭转移亦密切关系［5⁃6］。最近SAITO等［7］研究发现，通过RNA干扰技术下调舌鳞癌细胞株HSC⁃3的Ezrin表达水平，可造成β⁃catenin蛋白水平增加。但是在乳腺癌组织中同时检测Ezrin和β⁃catenin蛋白表达，笔者查阅国内外文献尚未见相关报道。本研究应用免疫组织化学染色法检测145例乳腺癌病理组织中Ezrin和β⁃catenin蛋白的表达水平，并分析二者相关性及其与乳腺癌临床资料和预后资料的相关性，以探讨Ezrin和β⁃catenin在乳腺癌中的临床意义。

1　材料与方法

1.1组织标本

本研究收集中国医科大学附属第一医院乳腺外科病房2004年至2008年间收治的145例女性乳腺癌患者手术切取的乳腺组织，组织标本于-80℃冰冻保存备用。患者术前均未接受放疗或化疗，采用世界卫生组织标准进行组织学判定。

1.2免疫组织化学染色

冰冻组织经室温解冻后，常规制作多聚甲醛固定、石蜡包埋组织块，切4 μm厚组织切片，固定于防脱载玻片上制成组织切片。组织切片经脱蜡及水化后，进行高压修复（80 kPa，10 min），然后用过氧化氢和正常山羊血清进行处理。滴加鼠抗人Ezrin单克隆抗体（ab4069，1∶100稀释，美国Abcam公司）或兔抗人β⁃catenin单克隆抗体（ab32572，1∶100稀释，美国Abcam公司）于4℃孵育过夜。次日，组织切片先后经生物素标记的二抗和链霉菌抗生物素蛋白-辣根过氧化酶（SP）复合物孵育，然后滴加DAB显色。最后，组织切片经苏木素复染、脱水、透明、封片后观察。阴性对照以PBS代替Ezrin、β⁃catenin等抗体，其他步骤不变。

1.3免疫组织化学染色结果的评判

组织切片免疫组织化学染色结果由2位临床病理医生进行盲法评价。Ezrin表达于细胞质中，β⁃catenin表达于细胞膜中。细胞染色强度计分：无染色计为0，弱阳性计为1，中等强度计为2，强阳性计为3。染色细胞百分率（0～100%）与染色强度计分之积计为总分（0～300%）。采用受试者工作特征曲线分析以总分评判生存状态的界值作为定义蛋白阴性表达和阳性表达的界值（图1），结果显示Ezrin 和β⁃catenin的界值分别为175%和167.5%。因此，定义总分＜175%为Ezrin阴性表达，总分≥175%为Ezrin阳性表达；定义总分＜167.5%为β⁃catenin阴性表达，总分≥167.5%为β⁃catenin阳性表达。

1.4统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。应用Spearman相关分析Ezrin与β⁃catenin蛋白表达的相关性，采用χ2检验或Fisher′s确切概率法分析Ezrin 和β⁃catenin蛋白表达水平与乳腺癌临床资料的相关性，采用log⁃rank检验分析2组生存率的差异，采用Cox回归进行多变量分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1病例的病理参数特征

图1　　受试者工作特征曲线分析Ezrin和β⁃catenin免疫组化染色总分评判患者生存状态的界值Fig.1　The receiver operating characteristic curve analysis with respect to survival state was used to determine the cutpoint of the immu⁃nohistochemical total score for Ezrin and β⁃catenin

本研究共收集145例散发性乳腺癌患者病理组织样本，其中年龄≤50岁68例，＞50岁76例；绝经前患者72例，已绝经患者69例；病理诊断为导管癌118例，小叶癌17例；组织学分级Ⅰ级60例，Ⅱ～Ⅲ79例；TNM分期Ⅰ期20例，Ⅱ期61例，Ⅲ期21例；发生淋巴结转移61例，无淋巴结转移84例。对145例患者进行随访以获得生存资料，随访时间9～118个月，患者5年生存率为69.0%，患者总体生存期（overall survival，OS）平均为（96.9±2.7）个月，无病生存期（disease free survival，DFS）平均为（88.8±3.1）个月。

2.2乳腺癌组织中Ezrin与β⁃catenin蛋白表达及二者相关性

免疫组织化学检测145例散发性乳腺癌组织中Ezrin与β⁃catenin蛋白表达（图2），发现Ezrin阳性表达70例，阳性率为48.3%；β⁃catenin阳性表达82例，阳性率为56.6%。进一步分析二者表达相关性，发现二者呈显著负相关（r=-0.267，P=0.001）。

2.3Ezrin和β⁃catenin蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的相关性

图2　　乳腺癌中Ezrin与β⁃catenin免疫组化染色的典型图片 SP法×400Fig.2　Representative micrographs showing immunohistochemical staining of Ezrin and β⁃catenin in breast cancer tissues SP×400

采用χ2检验或Fisher′s确切概率法分析Ezrin和β⁃catenin蛋白表达与乳腺癌患者临床资料的相关性（表1），结果发现，与组织学分级Ⅰ级的组织相比，Ⅱ～Ⅲ级的乳腺癌组织Ezrin表达水平显著升高（P= 0.007），β⁃catenin表达水平显著降低（P＜0.001）；与未发生淋巴结转移的组织相比，发生淋巴结转移的乳腺癌组织Ezrin表达水平显著升高（P=0.027），β⁃catenin表达水平显著降低（P=0.011）。

2.4Ezrin与β⁃catenin蛋白表达对乳腺癌患者预后的影响

应用log⁃rank检验分析Ezrin与β⁃catenin蛋白表达水平对乳腺癌患者OS及DFS的影响（图3），结果发现，Ezrin蛋白表达与乳腺癌患者OS（P=0.004）及DFS（P=0.017）缩短显著相关（图3A、3C），β⁃catenin阳性表达则可显著延长患者OS（P＜0.001）及DFS （P=0.001，图3B、3D）。

引入年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、Ezrin蛋白表达、β⁃catenin蛋白表达等因素，进行多变量Cox回归分析（表2），结果发现，肿瘤大小（OS，P=0.008；DFS，P=0.002）、组织学分级（OS，P=0.002；DFS，P=0.006）、TNM分期（OS，P= 0.008；DFS，P=0.006）为影响预后的独立风险因素。此外，淋巴结转移是影响患者DFS的独立风险因素（P=0.002）。而Ezrin、β⁃catenin蛋白表达不是影响乳腺癌预后的独立风险因素。

3　讨论

Ezrin和β⁃catenin是参与调解肿瘤侵袭转移的2个重要蛋白。本研究通过免疫组织化学染色法检测了145例散发性乳腺癌中Ezrin和β⁃catenin蛋白表达水平，发现二者呈显著负相关。相关的研究报道中，如SAITO［7］在舌鳞癌细胞中发现，通过下调Ezrin表达可导致β⁃catenin蛋白水平增加；而国内胡雪梅［8］对卵巢癌组织的研究发现Ezrin表达与β⁃catenin呈正相关，与本研究相悖。这可能是由于卵巢组织与乳腺组织的特异性所致，或者对β⁃catenin表达部位限定的差异造成。胡雪梅考察了细胞膜和细胞质中的β⁃catenin表达，而本研究只考察了细胞膜上正常的β⁃catenin表达，未考察细胞质和细胞核中的异常表达。

分析Ezrin和β⁃catenin与乳腺癌临床资料及生存资料的相关性，发现Ezrin表达与较高的组织学分级和淋巴结转移正相关，而β⁃catenin则与之负相关；且Ezrin与生存期缩短相关，β⁃catenin与生存期延长相关。这与已有的Ezrin的相关报道结果一致［3⁃4］。在已有的β⁃catenin的相关报道［9⁃11］中，β⁃catenin异常表达（非细胞膜位置）将失去介导细胞间链接、黏附的功能，并引起某些癌基因的转录，导致细胞癌变、转移；并且MEI等［12］应用meta分析，发现β⁃catenin表达水平下降可导致非小细胞肺癌患者预后不良。可见，在乳腺癌中Ezrin促进细胞恶化及侵袭转移和不良预后，而β⁃catenin则相反。但Ezrin和β⁃catenin并不是影响乳腺癌患者生存期的独立风险因素，这可能是因为二者的作用与淋巴结转移有关，进而影响预后，而非直接作用。

表1　Ezrin和β⁃catenin蛋白表达与乳腺癌患者临床资料的相关性Tab.1　Association of Ezrin and β⁃catenin expression with clinicopathological features of breast cancer

图3　Ezrin与β⁃catenin蛋白表达对乳腺癌患者预后的影响Fig.3　Analysis of the prognostic significance of Ezrin and β⁃catenin in breast cancer patients

综上所述，笔者认为，在乳腺癌转移、恶化等病程进展及不良预后过程中，Ezrin和β⁃catenin均发挥了一定作用，且二者密切相关，因此Ezrin和β⁃catenin可作为乳腺癌治疗方案的作用靶点。

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表2　　多变量Cox回归分析乳腺癌临床病理参数对患者生存期的影响Tab.2　Multivariate Cox regression analysis of clinicopathological data correlated with OS and DFS in breast cancer

（编辑陈姜）

Correlation and Clinical Significance of Ezrin and β⁃catenin Protein Expression in Sporadic Breast Cancer

ZHAO Lin，YU Zhaojin，HE Miao，SUN Mingli，WEI Minjie
（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of Ezrin and β⁃catenin in breast cancer.MethodsImmunohistochemical staining method was adopted to detect Ezrin and β⁃catenin protein expression level in 145 cases of breast cancer tissues，and their correlation with clinical data and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsEzrin was expressed in 70 cases（48.3%），β⁃catenin was expressed in 82 cases （56.6%），and there was significantly negative correlation（r=0.267，P=0.001）.The higher histologic grade of breast cancer，the higher expres⁃sion level of Ezrin（P=0.007），and the lower expression level of β⁃catenin（P＜0.001）.Ezrin expression level was increased significantly（P= 0.027），but β⁃catenin expression level was reduced significantly（P=0.011）in lymph node positive breast cancer tissue.Ezrin expression was sig⁃nificantly correlated with shorter overall survival（P=0.004）and disease free survival（P=0.017）of breast cancer patients，but β⁃catenin expres⁃sion was significantly correlated with longer overall survival（P＜0.001）and disease free survival（P=0.001）of breast cancer patients.However，Ezrin and β⁃catenin were not the independent risk factors of breast cancer patients as determined by multivariate Cox regression.ConclusionEz⁃rin was significantly negative correlated with β⁃catenin in breast cancer.They play a role in the progression and poor prognosis of breast cancer，which can be used as breast cancer treatment targets.

breast cancer；Ezrin；β⁃catenin；metastasis；prognosis

R73⁃3

A

0258-4646（2016）08-0673-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.08.001

国家自然科学基金（81373427）；辽宁省科学技术计划本溪生物医药产业集群项目（2014226033）；辽宁省高等学校创新团队项目（LT2014016）

赵琳（1979-），女，副教授，博士.

魏敏杰，E-mail：weiminjiecmu@163.com

2015-12-09
网络出版时间：