淋巴结转移阳性乳腺癌中Ezrin相关的上皮钙黏蛋白表达亚细胞定位的临床意义

于兆进，何苗，孙明立，赵海山，魏敏杰，赵琳

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

淋巴结转移阳性乳腺癌中Ezrin相关的上皮钙黏蛋白表达亚细胞定位的临床意义

于兆进，何苗，孙明立，赵海山，魏敏杰，赵琳

（中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122）

目的探讨Ezrin与上皮钙黏蛋白（E⁃cad）表达部位的相关性及其对乳腺癌淋巴结转移等病理特征的影响。方法收集淋巴结转移阳性乳腺癌组织样本94例，采用免疫组化方法检测Ezrin和E⁃cad的表达情况。结果E⁃cad和Ezrin阳性表达率分别为45.7%和58.5%；E⁃cad表达于细胞膜者（E⁃cadm）20例，表达于细胞质者（E⁃cadc）23例；与Ezrin阴性组织相比，Ezrin阳性组织中E⁃cadc表达频率显著增高（P=0.025）；在TNM分期较高（Ⅱ～Ⅲ）的组织中E⁃cad表达水平显著降低（P=0.001）；在较大的肿瘤组织中，Ezrin表达水平显著增高（P=0.036），E⁃cadc表达频率显著高于E⁃cadm（P=0.013）；与E⁃cad（+）、Ezrin（-）、E⁃cadm组织相比，E⁃cad（-）、Ezrin（+）、E⁃cadc组织淋巴结转移数目显著增多（P＜0.05）；乳腺癌组织特征按照E⁃cad（+）/Ezrin（-）、E⁃cad（-）/ Ezrin（-）、E⁃cad（+）/Ezrin（+）、E⁃cad（-）/Ezrin（+）的顺序（P＜0.001），或者E⁃cadm/Ezrin（-）、E⁃cadc/Ezrin（-）、E⁃cadm/Ezrin（+）、E⁃cadc/Ezrin（+）的顺序（P=0.007），淋巴结转移的数目均依次增多。结论在转移性乳腺癌中，Ezrin可能调节E⁃cad的亚细胞定位，从而协同影响乳腺癌病程，促进淋巴结转移。

Ezrin；上皮钙黏蛋白；亚细胞定位；乳腺癌；淋巴结转移

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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。近年来，虽然乳腺癌的治疗取得了较大进展，但乳腺癌侵袭转移依然严重影响其治疗效果及预后。因此对影响乳腺癌侵袭转移因素的研究具有重要意义。

上皮钙黏蛋白（E⁃cadherin，E⁃cad）是维持上皮细胞间链接的钙黏素家族成员，其表达下调参与肿瘤的侵袭转移［1⁃2］。Ezrin是ERM蛋白家族成员之一［3］，通过调节细胞黏附影响肿瘤细胞的侵袭、转移等生物学行为，因此被认为是肿瘤转移的关键调节因子［4⁃5］。PUJUGUET等［6］研究认为，Ezrin可以促使E⁃cad从细胞膜募集到细胞质，从而抑制E⁃cad的作用，导致细胞侵袭转移。目前，在乳腺癌组织中，关于Ezrin与E⁃cad表达部位和乳腺癌淋巴结转移的相关性，国内尚未见相关报道。

本研究采用免疫组化法检测了94例发生淋巴结转移的散发性乳腺癌组织中Ezrin和E⁃cad的表达情况，并分析二者表达水平的相关性，以及二者表达水平与乳腺癌淋巴结转移等临床资料的相关性，以探讨Ezrin与E⁃cad表达部位的相关性，及对乳腺癌淋巴结转移等病理特征的影响。

1　　材料与方法

1.1研究对象

在中国医科大学附属第一医院乳腺外科病房2006年至2007年收治的女性乳腺癌患者中，选取病理检查为淋巴结转移阳性的患者，收集组织样本共94例，-80℃冰冻保存。患者术前均未接受放疗或化疗，以WHO标准［7］进行组织学判定。

本研究94例女性乳腺癌患者中，导管癌75例，小叶癌13例，其他类型癌（黏液癌、髓样癌、筛状癌）6例；患者年龄32～79岁，平均年龄（51.2±9.2）岁，其中≤50岁者44例（46.8%），＞50岁者50例（53.2%）；有44例（49.4%）已绝经；肿瘤组织块最大径＞2.0 cm 者37例（47.4%），≤2.0 cm者41例（52.6%）；淋巴结转移数目1～27个；患者采用TNM分期系统进行临床分期，Ⅰ期1例（1.5%），Ⅱ期40例（59.7%），Ⅲ期26例（38.8%）；肿瘤组织分级Ⅰ级者43例（47.8%），Ⅱ～Ⅲ级者47例（52.2%）。上述乳腺癌患者临床资料在部分病例中存在缺失。

1.2免疫组化检测

冰冻组织经室温解冻后，以4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡包埋组织块，切4 μm厚组织切片，固定在防脱载玻片上。然后依次经二甲苯脱蜡，降梯度乙醇脱苯、水化。将组织切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），80 kPa高压修复10 min。组织切片经3%过氧化氢或甲醇及10%非免疫性正常山羊血清处理后，滴加鼠抗人E⁃cad、Ezrin单克隆抗体（E⁃cad，ab1416，1∶100稀释；Ezrin，ab4069，1∶100稀释；Abcam，UK）4℃孵育过夜。次日组织切片先后经生物素标记的二抗（1∶200稀释）和链霉菌抗生物素蛋白-辣根过氧化酶复合物（LSAB kit；Dako，Glostrup，Denmark）孵育，然后滴加新鲜配制的DAB （3，3⁃diaminobenzidine）溶液显色。最后，切片经苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后观察。同步操作阴性对照，采用PBS液代替E⁃cad、Ez⁃rin等抗体，其他步骤不变。

免疫组化染色结果的评判：组织切片组化染色结果由2位有经验的临床病理医生进行盲法评价。E⁃cad表达于细胞质、细胞膜，Ezrin表达于细胞质。参照GILLETT等［7］的方法对染色结果进行评分。对细胞膜染色强度计分，无染色计为0分，稀疏散在的染色计为1分，中度至重度染色且易于辨认未染色细胞计为2分，重度染色且各细胞连成一体计为3分；细胞质染色强度计分为：无染色计为0分，弱阳性计为1分，中等强度计为2分，强阳性计为3分。为便于统计学分析，染色强度0～1分定义为阴性表达，染色强度2～3分定义为阳性表达。

1.3统计学分析

应用SPSS 16.0软件处理数据，Ezrin、E⁃cad表达水平及其与乳腺癌临床资料相关性采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法进行分析，应用Spearman等级相关分析Ezrin与E⁃cad的相关性，应用Wilcox⁃on秩和检验及Kruskal⁃WallisHtest法分析不同组别淋巴结转移数目的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　　结果

2.1淋巴结转移阳性乳腺癌组织中Ezrin和E⁃cad的表达和相关性

应用免疫组化法检测了Ezrin和E⁃cad的表达情况，2种蛋白在乳腺癌组织中的阳性染色见图1。94例淋巴结转移阳性乳腺癌组织中，Ezrin阳性表达率为58.5%（55/94）；E⁃cad阳性表达率为45.7%（43/ 94），其中表达于细胞膜者（E⁃cadm）20例（46.5%），表达于细胞质者（E⁃cadc）23例（53.5%）。

应用Spearman等级相关分析E⁃cad，Ezrin表达水平之间的相关性，结果提示无显著相关性。进一步分析Ezrin表达与E⁃cad表达部位的相关性（图2），发现在Ezrin阴性表达的组织中E⁃cadm表达12例（66.7%），E⁃cadc表达6例（33.3%），在Ezrin阳性表达的组织中E⁃cadm表达8例（32.0%），E⁃cadc表达17例（68.0%）。应用Pearson χ2检验分析发现，与Ezrin阴性的组织相比，Ezrin阳性的组织中E⁃cadc表达频率显著增高（P=0.025）。

图1　　淋巴结转移阳性乳腺癌组织中Ezrin和E⁃cad免疫组化染色 ×400Fig.1　Immunohistochemical staining of Ezrin and E⁃cad in nodes positive breast cancer tissues×400

2.2Ezrin和E⁃cad表达与淋巴结转移阳性乳腺癌临床资料的相关性

采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法分析E⁃cad和Ezrin表达与乳腺癌患者临床资料的相关性（表1），发现与TNMⅠ期的乳腺癌相比，在TNM分期较高（Ⅱ～Ⅲ）的乳腺癌组织中E⁃cad表达水平显著降低（P=0.001）；在最大径＞2.0 cm的肿瘤组织中，Ezrin表达水平显著增高（P=0.036），E⁃cadc表达频率显著高于E⁃cadm（P=0.013）。E⁃cad和Ezrin表达与年龄、绝经状态、肿瘤类型、组织学分级等其他临床资料均无显著相关性（P＞0.05）。

2.3Ezrin和E⁃cad表达对乳腺癌淋巴结转移数目的影响

应用Wilcoxon秩和检验及Kruskal⁃WallisHtest法，本研究分析了Ezrin和E⁃cad表达对乳腺癌淋巴结转移数目的影响（图3）。发现与E⁃cad阳性组织相比，E⁃cad阴性组织淋巴结转移数目显著增多（P=0.011，图3A）；与Ezrin阴性组织相比，Ezrin阳性组织淋巴结转移数目显著增多（P=0.002，图3B），与E⁃cadm的组织相比，E⁃cadc的组织淋巴结转移数目显著增多（P=0.020，图3C）；此外，乳腺癌组织按照E⁃cad（+）/Ezrin（-）、E⁃cad（-）/Ezrin（-）、E⁃cad（+）/Ezrin（+）、E⁃cad（-）/Ezrin（+）4个分组的顺序，淋巴结转移的数目依次增多且差异显著（P＜ 0.001，图3D）；与之类似，按照E⁃cadm/Ezrin（-）、E⁃cadc/Ezrin（-）、E⁃cadm/Ezrin（+）、E⁃cadc/Ezrin（+）组织的顺序，淋巴结转移的数目依次增多且差异显著（P=0.007，图3E）。

图2　　不同Ezrin表达水平的淋巴结转移阳性乳腺癌组织中E⁃cadherin表达部位的比较Fig.2　Comparison of E⁃cadherin localization in nodes positive breast cancer tissues with different Ezrin expression level

3　　讨论

相对于已有的研究［8-9］，本研究选择了94例淋巴结转移阳性散发性乳腺癌进行E⁃cad和Ezrin表达水平的检测，并深入分析了Ezrin与E⁃cad表达亚细胞定位的相关性。研究发现E⁃cad表达于乳腺癌细胞质、细胞膜，Ezrin主要表达于细胞质。此外，与Ezrin阴性的组织相比，Ezrin阳性的组织中E⁃cadc表达频率显著增高，提示乳腺癌中Ezrin可促使E⁃cad由胞膜表达转位到胞质表达，这与ELLIOTT等［10］和PUJUGUET等［6］的报道一致。因此，在乳腺癌中Ezrin可能参与E⁃cad的表达调节。

本研究分析了E⁃cad和Ezrin的表达水平与淋巴结转移阳性乳腺癌患者临床资料的相关性，发现随着TNM分期增加，E⁃cad表达显著降低；Ezrin阳性表达或者E⁃cadc表达的肿瘤组织具有更大的直径。结果提示E⁃cad表达减少或者异位表达于细胞浆，以及Ezrin表达增加，可能参与了乳腺癌的发生发展。

表1　E⁃cad和Ezrin表达与淋巴结转移阳性乳腺癌患者临床资料的相关性Tab.1　Association of E⁃cad and Ezrin expression with clinicopathological features of nodes positive breast cancer

图3　Ezrin和E⁃cad表达对乳腺癌淋巴结转移数目的影响Fig.3　Influence of E⁃cad and Ezrin expression to the number of nodes metastasis

本研究重点分析了E⁃cad和Ezrin对乳腺癌淋巴结转移数目的影响，结果提示E⁃cad可抑制淋巴结转移，而Ezrin则促进淋巴结转移，这与已有的研究结果一致［10-13］。并且发现E⁃cad（+）/Ezrin（-）组织淋巴结转移数目减少，而E⁃cad（-）/Ezrin（+）组织淋巴结转移数目则增加，这表明E⁃cad和Ezrin二者调节淋巴结转移作用具有协同性。研究［14］发现，E⁃cad表达在细胞膜时，可发挥稳定细胞连接、抑制细胞迁徙的功能，但表达在细胞质的E⁃cad则无此功能，相反可促进细胞转移。因此，本研究进一步分析了E⁃cad表达部位对乳腺癌淋巴结转移数目的影响，结果表明E⁃cadm可抑制淋巴结转移，而E⁃cadc则促进淋巴结转移，这与LAPYCKYJ等［15］的研究结果一致。并且E⁃cadm/Ezrin（-）组织淋巴结转移数目减少，E⁃cadc/Ezrin（+）组织淋巴结转移数目则增加，这表明E⁃cadc和Ezrin二者调节淋巴结转移作用具有协同性。

综上所述，本研究对94例淋巴结转移阳性的乳腺癌组织检测发现，E⁃cad表达减少促进了乳腺癌的病程进展，Ezrin表达增加或者E⁃cadc表达有助于乳腺癌肿瘤组织生长；E⁃cad可抑制淋巴结转移，而Ez⁃rin则促进淋巴结转移，且二者作用具有协同性；同时还发现Ezrin表达可促使E⁃cad由胞膜表达转位到胞质表达，E⁃cadc表达可促进淋巴结转移，且Ezrin和E⁃cadc可协同促进淋巴结转移。上述结果表明，在转移性乳腺癌中，Ezrin可能调节E⁃cad的亚细胞定位，从而协同影响乳腺癌病程，促进淋巴结转移。因此，在转移性乳腺癌中，以E⁃cad和Ezrin作为靶点，有可能实现有效治疗。

［1］WANG WS，YU SL，et al.Expression and significance of twist and E⁃cadherin in ovarian cancer tissues［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（2）：669-672.

［2］WANG C，JIANG K，KANG X，et al.Tumor⁃derived secretory clus⁃terin induces epithelial⁃mesenchymal transition and facilitates hepa⁃ tocellular carcinoma metastasis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2012，44（12）：2308-2320.DOI：10.1016/j.biocel.2012.09.012.

［3］BRETSCHERA.Regulationofcorticalstructurebytheezrin⁃radixin⁃moesin protein family［J］.Curr Opin Cell Biol，1999，11（1）：109-116.

［4］YU Y，KHAN J，KHANNA C，et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeopro⁃tein Six⁃1 as key metastatic regulators［J］.Nat Med，2004，10（2）：175-181.

［5］YU H，ZHANG Y，YE L，et al.The FERM family proteins in cancer invasion and metastasis［J］.Front Biosci（Landmark Ed），2011，16：1536-1550.

［6］PUJUGUET P，DEL MAESTRO L，GAUTREAU A，et al.Ezrin regu⁃lates E⁃cadherin⁃dependent adherens junction assembly through Rac1 activation［J］.Mol Biol Cell，2003，14（5）：2181-2191.

［7］SINN HP，KREIPE H.A brief overview of the WHO classification of breast tumors，4th edition，focusing on issues and updates from the 3rd edition［J］.Breast Care（Basel），2013，8（2）：149-154. DOI：10.1159/000350774.

［8］GILLETT CE，MILES DW，RYDER K，et al.Retention of the expres⁃sion of E⁃cadherin and catenins is associated with shorter survival in gradeⅢductal carcinoma of the breast［J］.J Pathol，2001，193（4）：433-441.

［9］LI Q，WU M，WANG H，et al.Ezrin silencing by small hairpin RNA reverses metastatic behaviors of human breast cancer cells［J］.Can⁃cer Lett，2008，261（1）：55-63.

［10］ELLIOTT BE，MEENS JA，SENGUPTA SK，et al.The membrane cytoskeletal crosslinker ezrin is required for metastasis of breast carcinoma cells［J］.Breast Cancer Res，2005，7（3）：R365-373.

［11］BERX G，CLETON⁃JANSEN AM，NOLLET F，et al.E⁃cadherin is a tumour/invasion suppressor gene mutated in human lobular breast cancers［J］.EMBO J，1995，14（24）：6107-6115.

［12］LIPPONEN P，SAARELAINEN E，JI H，et al.Expression of E⁃cad⁃herin（E⁃CD）as related to other prognostic factors and survival in breast cancer［J］.J Pathol，1994，174（2）：101-109.

［13］KHANNA C，WAN X，BOSE S，et al.The membrane⁃cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis［J］.Nat Med，2004，10（2）：182-186.

［14］TAKEICHI M.Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenet⁃ic regulator［J］.Science，1991，251（5000）：1451-1455.

［15］LAPYCKYJ L，CASTILLO LF，MATOS ML，et al.Expression anal⁃ysis of epithelial cadherin and related proteins in IBH⁃6 and IBH⁃4 human breast cancer cell lines［J］.J Cell Physiol，2010，222（3）：596-605.DOI：10.1002/jcp.21974.

（编辑于溪）

Clinical Significance of Ezrin Associated Subcellular Localization of E⁃cadherin Expression
in Lymph Nodes Positive Breast Cancer

YU Zhaojin，HE Miao，SUN Mingli，ZHAO Haishan，WEI Minjie，ZHAO Lin

（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between Ezrin expression and subcellular localization of E⁃cadherin（E⁃cad），and explore the clinical significance of this relationship to pathological features such as lymph nodes metastasis in breast cancer.MethodsNinety four cases of breast cancer tissue samples with lymph node metastasis were collected.The expression of Ezrin and E⁃cad was detected by immunohistochemi⁃cal method.ResultsThe positive rates of and E⁃cad and Ezrin were respectively 45.7%and 58.5%in 94 nodes positive breast cancer，containing membranal expression of E⁃cad（E⁃cadm）in 20 cases and cytoplasmic expression of E⁃cad（E⁃cadc）in 23 cases；the frequency of E⁃cadc positive staining was significantly higher in Ezrin（+）tissues than that in Ezrin（-）tissues（P=0.025）；E⁃cad expression level was significantly lower in TNMⅡ⁃Ⅲstage cases（P=0.001），and Ezrin expression（P=0.036）and E⁃cadc（P=0.013）was significantly increased in bigger cases；com⁃pared with E⁃cad（+），Ezrin（-），E⁃cadmtissues，the number of lymph node metastasis in E⁃cad（-）（P=0.011），Ezrin（+）（P=0.002），E⁃cadc（P=0.020）tissues were increased significantly；in the order of E⁃cad（+）/Ezrin（-），E⁃cad（-）/Ezrin（-），E⁃cad（+）/Ezrin（+），and E⁃cad（-）/ Ezrin（+），the number of lymph node metastasis was increased significantly（P＜0.001）；similarly，in the order of E⁃cadm/Ezrin（-），E⁃cadc/ Ezrin（-），E⁃cadm/Ezrin（+），and E⁃cadc/Ezrin（+），the number of lymph node metastasis was increased significantly（P=0.007）.Conclusion Ezrin may regulate the subcellular localization of E⁃cad in metastatic breast cancer，which may affect the course of breast cancer and promote the metastasis of lymph nodes.

Ezrin；E⁃cadherin；subcellular localization；breast cancer；lymph nodes metastasis

R733.7

A

0258-4646（2016）08-0695-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.08.006

辽宁省高等学校创新团队支持计划（LT2014016）；沈阳市科学技术计划（F14⁃232⁃6⁃05）

于兆进（1983-），男，讲师，博士研究生.

赵琳，E-mail：zl_cmu@163.com

2015-11-19
网络出版时间：