四川晒制麸醋中醋酸菌分离鉴定及产酸特性

刘有晴，倪月，黄丹，鄢平，程华，于华，毛祥（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）



四川晒制麸醋中醋酸菌分离鉴定及产酸特性

刘有晴，倪月，黄丹*，鄢平，程华，于华，毛祥
（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

摘要：对四川晒制麸醋醋醅中的醋酸菌采用传统可培养的分离方法进行分离鉴定，并对该菌在不同pH、发酵温度、供氧量条件下的产酸能力进行研究。结果表明：分离获得了一株产酸能力较强的菌株，经16SrDNA鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。通过对其产酸特性进行研究，该菌株的最适产酸条件为：最适初始pH 5.0，最适温度为35℃，摇床转速为150r/min，总酸含量可达2.8884g/100mL。

关键词：醋醅；醋酸菌；分离鉴定；产酸特性

四川晒制麸醋是以麦麸为酿制食醋的主要原料，以药曲为糖化发酵剂，采用糖化、酒精发酵、醋酸发酵同池进行发酵生产［1］，其醋醅需经过3年左右的晒制，期间日晒夜露，微生物类群交替作用，形成了其独特风味。

醋酸菌是专性好氧细菌，其氧化乙醇为乙酸的作用是由于它的细胞膜上含有高活性的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶复合体。不同醋酸菌其发酵产物不同，醋酸菌除了主要生成醋酸外，还能生成羟基酸，如羟基乙酸、草酸、酒石酸、己二酸、琥珀酸、甘露糖酸和葡萄糖酸等。醋酸中残留的乙醇又与这些酸类发生酯化反应生成不同的酯类，构成食醋中的香气成分［2］。因此醋酸菌在食醋酿造过程中有非常重要的作用。

目前，关于食醋中醋酸菌的研究非常活跃，但都是针对四大名醋中镇江香醋、山西老陈醋［3-4］中醋酸菌分离鉴定及初步应用等方面，关于四川晒制麸醋中醋酸菌的研究还鲜见报道。本文主要针对四川晒制麸醋中的醋酸菌进行筛选、分离纯化及鉴定，并对获得的醋酸菌产酸特性进行研究，对改善四川晒制麸醋长期以来存在的出醋率低、生产周期长的现状，具有积极意义。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1试验材料

麸醋醋厂醋醅。

1.1.2主要培养基

分离纯化培养基：葡萄糖1g，酵母膏1g，碳酸钙2g，琼脂2 g，水100 mL，121℃灭菌20 min，冷却至70℃加入3.5 mL无水乙醇［5］；斜面试管保藏培养基：除不加碳酸钙外，其他同分离纯化培养基；发酵培养基：酵母膏1 g，葡萄糖1 g，硫酸镁0.05 g，磷酸二氢钾0.05 g，水100 mL，灭菌后加入7%（体积分数）无水乙醇。

1.1.3主要仪器设备

超净工作台：苏州净化设备厂；LRH-250生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；高速冷冻离心机：德国Hettich公司；PCR仪：美国BIA-RAD公司；凝胶成像系统：上海山富科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株分离

称取5.0 g醋醅于装有45 mL无菌生理盐水的三角瓶中，使之稀释浓度为10-1。再从该三角瓶中取1 mL于装有9 mL无菌生理盐水的试管中，依次稀释，使醋醅的浓度梯度为10-4、10-5、10-6。分别取10-4、10-5、10-6的稀释液0.2 mL涂抹平板分离培养基上，30℃培养48 h后观察。根据醋酸菌的形态特征及碳酸钙溶菌圈的大小挑取醋酸菌单菌落。把分离得到的单菌落在平板上多次划线分离、培养，通过革兰氏染色镜检确认是形态单一的单菌落后，移种于试管斜面，培养，备用。

1.2.2菌株形态学鉴定

1.2.2.1形态学观察

对已分离出的菌株进行革兰氏染色。

1.2.2.2醋酸钙鉴定试验

醋酸钙鉴定培养基：酵母膏1 g，醋酸钙1 g，琼脂2.5 g，水100 mL，pH 7.2左右。观察平板是否出现透明圈。

1.2.2.3醋酸定性试验

醋酸定性液体培养基：酵母膏1 g，水100 mL，灭菌后加入无水乙醇7mL，pH4.5。鉴定方法：35℃150 r/min摇瓶5d，取培养液加NaOH中和，再加10%FeCl3，2滴～3滴，摇匀，在火焰上加热，观察是否有红褐色沉淀生成［6］。

1.2.3菌株16SrDNA鉴定［7］

分子生物学鉴定流程：基因组DNA的提取（SDS裂解法）→电泳→PCR扩增→电泳→测序（上海杰李生物测序公司）→NCBI/Blast Nucleotide比对→构建系统发育树。

1.2.4醋酸菌产酸特性研究

1.2.4.1初始pH对分离菌株产酸能力的影响

取7个250 mL三角瓶编号，加入25 mL发酵培养基，接种2%（体积分数）醋酸菌菌悬液。分别于pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下在上述最佳温度及摇床转速下培养48 h，测定总酸（以醋酸计），确定最适发酵初始pH［8］。

1.2.4.2温度对分离菌株产酸能力的影响

取5个250 mL三角瓶编号，加入25 mL发酵培养基，接种2%（体积分数）醋酸菌菌悬液，分别于25、30、35、40、45℃温度下，自然pH下150 r/min摇床培养48 h，测定总酸，确定最适发酵温度。

1.2.4.3供氧量对分离菌株产酸能力的影响

取5个250 mL三角瓶编号，加入25 mL发酵培养基，接种2%（体积分数）醋酸菌菌悬液。分别于100、125、150、175、200 r/min，在自然pH、最佳培养温度下培养48 h，测定总酸，确定最适发酵供氧量。

2　结果与分析

2.1醋酸菌形态学观察

2.1.1菌株菌落形态及细胞形态观察

通过分离纯化培养基测定其透明圈的大小，筛选出一株产酸能力强的醋酸菌，命名为J8。在分离纯化平板中菌株的菌落形态为：菌落呈圆形、中间隆起、边缘波状、表面平滑。通过革兰氏染色看到分离菌株为革兰氏阴性菌，短杆状。

2.1.2醋酸钙鉴定试验

从醋酸钙鉴定试验中可知：该菌株菌落周围形成的不透明的白色晕圈，该白色晕圈成分为碳酸钙，醋酸菌可以将醋酸根继续氧化成碳酸根，碳酸根与钙离子结合成碳酸钙，从而形成白色晕圈，说明该菌株能利用酒精形成醋酸。

2.1.3醋酸定性试验

醋酸能够与铁离子在高温条件下发生配位反应而形成红褐色沉淀。对所分离出的菌株进行醋酸定性试验，试管中有红褐色沉淀生成，表明该菌株具有产醋酸的能力。

2.216SrDNA同源性序列分析及系统发育育树的构建

2.2.1DNA提取及PCR扩增结果

采用SDS裂解法将醋酸菌J8的纯菌DNA提取出，其电泳图如图1所示。经过PCR扩增后电泳结果如图2所示。

从图中可以看出PCR扩增后其DNA条带非常明显，而且没有存在拖带的现象。

2.2.2系统发育树的构建

通过对已提取出的DNA进行测序，该菌株经鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。通过NCBI进行同源序列比对，然后利用MEGA6.0软件对该菌株构建系统发育树如图3所示。

图1　纯菌DNA电泳图Fig.1　Electrophoresis of pure bacteria DNA

图2　PCR扩增电泳图Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification

图3　系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree

由图3可知，该菌株与巴氏醋杆菌BCRC 12325同源性最近，因此可以认为此菌株为巴氏醋杆菌。

2.3产酸特性研究

2.3.1发酵初始pH对分离菌株产酸的影响

pH对醋酸菌产酸能力的影响如图4所示。

图4　pH对醋酸菌产酸的影响Fig.4　Effect of pH value on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由图4可知，在pH为5.0左右该醋酸菌菌株产酸能力最强，总酸为2.378 0 g/100 mL。在酸性条件下醋酸菌产酸能力较强，而在中性或弱碱性条件下醋酸菌产酸能力急剧下降至0.822 7 g/100 mL。在麸醋酿制过程中，醋醅晒制过程中环境pH为酸性，而该菌株在酸性条件下能很好的生长及产酸，说明该菌株适合晒制麸醋的发酵生产。

2.3.2发酵温度对分离菌株产酸的影响

温度对醋酸菌产酸能力的影响如图5所示。

图5　温度对醋酸菌产酸能力的影响Fig.5　Effect of temperature on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由图5可知，温度对醋酸菌产酸能力有明显的影响，发酵温度控制在35℃左右该株醋酸菌产酸能力最强，总酸为2.702 3 g/100 mL。而当温度高于35℃时，该菌株产酸能力急剧下降至1.285 1 g/100 mL，由于温度太高导致该菌株生长缓慢，因此产酸能力呈现下降趋势。

2.3.3供氧量对醋酸菌产酸的影响

供氧量对醋酸菌产酸能力的影响如图6所示。

图6　供氧量对醋酸菌产酸能力的影响Fig.6　Effect of oxygen supply on the ability of producing acid by acetic acid bacteria

由图6可知，摇床转速控制在150 r/min左右该株醋酸菌产酸能力最强，其值为2.888 4 g/100 mL。转速偏低的情况下，供氧量不足，导致产酸能力受影响；转速过高时，虽然供氧量充足，但由于作为醋酸发酵底物的乙醇具有很强的挥发性［9］，转速偏高影响了乙醇的损耗速度，因此，转速在高于150 r/min时产酸量逐渐降低。

3　讨论

本试验通过从四川晒制麸醋醋醅中分离纯化出一株产酸能力强的醋酸菌，并经分子生物学鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。该菌株的最适产酸条件为：初始pH 5.0，最适温度为35℃，摇床转速为150 r/min，总酸含量可达2.888 4 g/100 mL。目前对四川晒制麸醋中功能菌的研究还很少，大量的研究，本文对醋酸菌的分离鉴定及最适产酸条件的研究，可为后续该菌株在晒制麸醋酿造过程中的应用研究提供数据支撑，同时也为四川晒制麸醋酿造工艺上采用纯菌发酵奠定基础。

参考文献：

［1］熊越.四川麸醋发酵过程中风味物质的变化研究［D］.重庆：西南大学，2011

［2］胡会萍.山西老陈醋醋酸菌遗传学分类鉴定及生产性能的研究［D］.山西：山西农业大学，2004

［3］胡会萍，郝林.山西老陈醋优势醋酸菌的分离鉴定［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2004，24（3）：283-285

［4］许伟.镇江香醋醋酸发酵过程微生物群落及其功能分析［D］.无锡：江南大学，2011

［5］恒顺调味品研究所.镇江香醋醋酸菌的分离筛选报告［J］.江苏调味副食品，1990（1）：9-12

［6］张忠明.高产醋酸菌的筛选及其形态生化特征研究［J］.甘肃农业大学学报，2006，41（1）：83-86

［7］魏长庆，王海庆，张凌，等.葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离及鉴定［J］.中国酿造，2010，217（4）：42-45

［8］郭丽萍，成剑峰，李丽娟，等.高活性醋酸菌的选育［J］.山西食品工业，2000（4）：30-32

［9］何志刚，李维新，林晓姿，等.枇杷酒醋化过程醋酸菌的生长、产酸及耗氧的关系［J］.食品与发酵工业，2008，34（12）：22-24

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.039

基金项目：四川省大学生创新创业计划（201410622006）；固态酿造关键技术研究四川省院士（专家）工作站基金项目（GY2015-02）；四川理工学院学科建设工程资助项目（2013TS13）；四川理工学院研究生创新基金（y2014026）；四川省经济和信息化委员会企业技术创新专项（2015LZ00264）

作者简介：刘有晴（1990—），女（汉），在读硕士，主要从事固态酿造功能微生物方面的研究。

*通信作者：黄丹（1968—），女，教授，本科，主要从事固态酿造微生物及应用方面的研究。

收稿日期：2015-05-26

Screen and Identification and Acid Characteristics of Acetic Acid Bacteria in Sichuan Bran Vinegar

LIU You-qing，NI Yue，HUANG Dan*，YAN Ping，CHENG Hua，YU Hua，MAO Xiang

（School of Biotechnoligy Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Abstract：Acetic acid bacteria in solid fermentation substrate of Sichuan bran-vinegar were isolated and identified by using traditional cultured separation method，and the acid producing ability under the condition of pH，different fermentation temperature，oxygen supply were studied.The results showed that：a strain had strong acid producing ability was isolated，it was named Acetobacter pasteurianus through the method of molecular biology.Through the research on its metabolic conditions，the optimal fermentation conditions of this strain：optimal initial pH 5.0，the optimal temperature 35℃，shaker speed 150 r/min，the acid content up to 2.888 4 g/100 mL. Key words：vinegar；acetic acid bacteria；isolate and identify；characteristics of acid production