大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

朱培，李崎，朱林江，贺鹏宇，李永仙*

1(江南大学 酿酒科学与工程研究室，江苏 无锡，214122)　2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)



大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

朱培1，李崎2，朱林江3，贺鹏宇4，李永仙1*

1(江南大学 酿酒科学与工程研究室，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

摘要大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点，被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工，但是其制备成本高，价格较昂贵。该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶。首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因，将该基因通过质粒pET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶。其次，对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析。结果表明，重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致，即59 kDa，重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg，最适作用温度降低了10 ℃，最适pH保持一致。所以，大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达，但是其酶学性质发生较大改变。

关键词大麦；β-淀粉酶；异源表达；大肠杆菌

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，主要存在于动物、植物以及微生物中[1]，一般作用于可溶性淀粉、糖原、α-1,4-葡聚糖等，水解其中的α-1,4-糖苷键。根据氨基酸序列的同源性，分属糖苷水解酶类的14族[2]。根据淀粉酶对淀粉的不同催化水解方式，可将其分为4种淀粉酶，即α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脱支酶。其中β-淀粉酶，又称α-1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶(EC3.2.1.2)，是一种外切型淀粉酶。它从淀粉的非还原性末端开始，依次切开间隔的α-1,4糖苷键，生成麦芽糖和β-极限糊精[3]，其在啤酒酿造、糖浆制造、纺织与医疗中具有重要应用[4-5]。

现有β-淀粉酶酶制剂主要来源于植物提取和微生物发酵生产。其中植物来源β-淀粉酶酶制主要提取于大麦、甘薯、大豆等粮食作物中[6]，而微生物生产β-淀粉酶酶制主要是通过枯草芽孢杆菌等表达生产。相比于微生物来源的β-淀粉酶，植物来源的β-淀粉酶具有酶活高、热稳定性好、pH作用范围广等特点[7]，所以受工业应用的偏爱，其中应用最广泛的是大麦来源的β-淀粉酶酶制剂。但是，大麦β-淀粉酶经过提取获得，不但消耗大量的大麦[8]，而且制备成本偏高，其价格高居不下。虽然微生物产β-淀粉酶可实现高酶活发酵，而且诱变后可提高其酶活力和热稳定性[9]，但是根据工厂应用经验，比如在制糖过程中，微生物产β-淀粉酶仍难以达到大麦来源酶制剂的使用效果。因此本论文将大麦β-淀粉酶基因导入大肠杆菌中进行异源表达[8,10]，研究大肠杆菌重组的β-淀粉酶的性质，同时将其与大麦来源的β-淀粉酶进行比较。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1β-淀粉酶基因来源

通过NCBI查得大麦来源β-淀粉酶基因序列(GenBank：D21349.1)，交付苏州金唯智生物科技有限公司合成，获得完整的密码子优化的大麦β-淀粉酶基因序列，预设计酶切位点为XhoI与NdeI。

1.1.2质粒以及其他试剂

质粒pMD19T-simple购自TaKaRa生物工程有限公司，表达载体pET28a(+)质粒，大肠杆菌JM109与BL21(DE3)均由本研究室保藏。TaqDNA polymerase、克隆载体pMD19T-simple、Mini BEST基因组提取试剂盒、感受态细胞制作试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶XhoI和NdeI购自TaKaRa生物工程有限公司；San prep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1重组表达载体的构建

大麦β-淀粉酶基因amyB首先插入到pMD19T-simple载体进行亚克隆以方便基因后续插入到pET28a(+)中，将重组质粒交由上海生工公司测序。双酶切获得目的基因，将目的基因与双酶切后的pET28a(+)质粒连接后，涂布与含硫酸卡那霉素的LB平板于37 ℃培养过夜，挑选阳性pET28a(+)-amyB重组表达质粒单菌落于50 mL LB培养基后，提取质粒进行双酶切验证。所有限制性酶切反应体系均参照试剂盒说明书配制。

1.2.2大肠杆菌的诱导表达

挑取含pET28a(+)-amyB重组表达质粒单菌落于含有硫酸卡纳霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min过夜培养；以4%的接种量转接到含硫酸卡纳霉素的50 mL的新鲜LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min培养至OD600≈1.0时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.06 mmol/L；转移至24 ℃ 150 r/min培养6 h后于4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，收集菌体及上清液；上清液经透析后使用蛋白超滤管浓缩，于4 ℃保存，同时培养含有空pET28a(+)质粒的宿主菌，诱导培养作为阴性对照。

1.2.3重组蛋白的收集与纯化鉴定[11-12]

菌液离心去其上清液，加入磷酸缓冲液悬浮后在冰浴条件下利用超声细胞破碎仪破碎细胞，使超声时间累积15 min(工作时间:4 s；间隙时间:6 s；工作次数:90)后4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，收集上清液，作为粗蛋白样品。用pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释10倍后，采用镍柱纯化和AKTA蛋白纯化系统进行分离，其中AKTA蛋白纯化选择阴离子交换色谱Mono Q。纯化结束后收集吸收峰，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4大麦来源β-淀粉酶的纯化

用pH 6.0磷酸缓冲液稀释大麦来源的β-淀粉酶酶制剂，采用AKTA蛋白纯化系统进行分离，选择凝胶柱Superdex G75。过柱完成后收集吸收峰，经过SDS-PAGE电泳进行检测。

1.2.5β-淀粉酶的酶学性质分析[13-14]

使用Megazyme公司的Beta-Amylase Assay Procedure试剂盒分别测定β-淀粉酶的最适温度(温度范围40～70 ℃)、50 ℃温度稳定性、最适pH(pH范围4.0～8.0)与pH 6.0时的稳定性。

2结果与分析

2.1pET28a(+)-amyB表达载体的构建与在大肠杆菌中的诱导表达

pET28a(+)-amyB的XhoI与NdeI双酶切结果如图1A所示，图中大小在1 600 bp左右为目的基因，测序结果证实重组质粒构建正确。将其重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE 3)中进行诱导表达。诱导表达后，收集破碎细菌液上清后经SDS-PAGE分析，由图1B可见，与诱导表达空pET28a(+)质粒的宿主菌相比较，重组载体诱导表达后在60 kDa左右处有明显的特异条带，说明新载体在诱导表达后有新蛋白产生，而大麦来源的β-淀粉酶的蛋白分子质量在59 kDa左右。此外，对该蛋白条带进行回收纯化，用于质谱鉴定，其肽段匹配结果与蛋白NCBI ID为gi|113786相似度最大，分子质量为59 609，为大麦β-淀粉酶来源。

(A)重组质粒pET28a(+)-amyB的XhoI与NdeI双酶切核酸电泳图M-DNAMarker；1-XhoI和NdeI双酶切)(B)重组质粒pET28a(+)-amyB大肠杆菌中的诱导表达β-淀粉酶电泳图M-蛋白质标准分子量；1-诱导含空质粒pET28a(+)的大肠杆菌胞内蛋白；2-诱导含质粒pET28a(+)-amyB的胞内蛋白图1　重组质粒pET28a(+)-amyB的双酶切验证与重组β-淀粉酶的诱导表达电泳图Fig.1　Digestion of recombinant plasmid and induced expression of recombinant β-amylase

2.2重组β-淀粉酶的纯化[15]

由于重组β-淀粉酶含有组氨酸标记，因此首选镍柱纯化粗酶液。多次重复试验表明目的蛋白与杂蛋白同时被洗脱，重组β-淀粉酶无法与镍柱结合。如图2A所示，目的蛋白随着杂蛋白在50 mmol/L咪唑浓度下一起被洗脱下来(箭头所示为目的蛋白)。因此改用AKTA蛋白纯化系统来纯化重组表达的β-淀粉酶。收集的上清液经过透析，超滤浓缩后，选择阴离子交换色谱柱Mono Q进一步纯化β-淀粉酶，通过预实验，采用含有0.15 mol/L NaCl pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰经过SDS-PAGE鉴定其中峰A6是BL21(DE3)异源表达的大麦β-淀粉酶，如图2C所示，纯化的最终结果得到1条单一的蛋白条带，大小在59 kDa左右。

(A)粗酶液的镍柱洗脱结果的SDS-PAGE电泳比较M-蛋白质标准分子量；1～6-洗脱液咪唑浓度分别为:20、50、100、150、200、250 mmol/L(B)粗酶液的MonoQ纯化峰图(C)重组β-淀粉酶的诱导表达电泳图M-蛋白质标准分子量；1-纯化前的重组蛋白；2-纯化后的重组蛋白图2　重组菌诱导表达β组淀粉酶的纯化Fig.2　Purification of expressed β-amylase

2.3大麦来源的β-淀粉酶的纯化

为了比较分析大肠杆菌中异源表达的β-淀粉酶性质，对同一大麦品种来源的β-淀粉酶制剂进行了纯化。使用AKTA蛋白纯化系统纯化大麦来源β-淀粉酶酶制剂，选择凝胶色谱柱Superdex G75纯化大麦β-淀粉酶，以pH 6.0的PBS洗脱。凝胶过滤色谱Superdex G75峰图见图3A，SDS-PAGE鉴定结果为峰B6为β-淀粉酶，纯化结果如图3B所示，SDS-PAGE得到单一清晰条带，蛋白分子质量在59 kDa附近。

(A)β-淀粉酶Superdex G-75纯化峰图(B)大麦来源β-淀粉酶的SDS-PAGE结果M-蛋白质标准分子量；1-纯化前的粗蛋白；2-纯化后的β-淀粉酶图3　大麦来源β-淀粉酶的纯化Fig.3　Purification of β-amylase from Barley

2.4重组β-淀粉酶与大麦来源β-淀粉酶的酶学性质比较

取纯化后的重组β-淀粉酶酶液(485.5 U/mL)与大麦来源纯化的β-淀粉酶酶液(10 000 U/mL)，使用爱尔兰Megazyme公司的Beta-Amylase Assay Procedure试剂盒专一性测定β-淀粉酶的酶活，从而比较比酶活、最适温度、温度稳定性、最适pH与pH稳定性，结果如表1所示。

表1　不同来源β-淀粉酶酶学性质的比较

如图4A所示，大麦来源的β-淀粉酶的最适温度为55 ℃，大肠杆菌重组表达的β-淀粉酶的最适温度变为45 ℃，与大麦来源β-淀粉酶相比，重组酶的最适温度下降了10 ℃。

分别在50 ℃条件下处理大麦来源、大肠杆菌表达的β-淀粉酶，测其酶活，结果如图4B所示。在50 ℃时，重组蛋白的半衰期相比原始β-淀粉酶减少了40 min，发现β-淀粉酶在大肠杆菌中重组表达后热稳定性显著下降。

使用不同pH的磷酸缓冲液比较β-淀粉酶酶活，在40 ℃条件下测其酶活，如图4C所示，两种β-淀粉酶的最适pH均为6.0。

在pH 6.0的磷酸缓冲液中，在40 ℃条件下测两种β-淀粉酶的pH稳定性，如图4D所示。两种β-淀粉酶的半衰期大概都在6 h左右，下降趋势差别不大，经过大肠杆菌的重组表达后，β-淀粉酶的pH稳定性与原大麦β-淀粉酶的pH稳定性相比基本保持不变。

(A)最适温度的比较；(B)50 ℃时的热稳定性的比较；(C)最适作用pH的比较；(D)pH 6.0时的稳定性的比较图4　重组β-淀粉酶与直接来源大麦的β-淀粉酶的酶学性质比较分析Fig.4　Comparative analysis of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified barley β-amylase

3讨论

论文针对大麦来源的β-淀粉酶在大肠杆菌中异源表达进行了研究，结果表明经过密码子优化的大麦β-淀粉酶能够在大肠杆菌中高效表达，通过SDS-PAGE分析能够清晰判断，高于之前的研究报道[16]。但是，经过凝胶色谱柱和离子交换柱纯化后的重组β-淀粉酶酶学性质与大麦中直接提取的β-淀粉酶具有一定差异。重组β-淀粉酶的热稳定性下降了10 ℃，比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg；而重组表达对酶的最适作用pH和pH稳定性影响不大。重组的β-淀粉酶的热稳定性和比酶活下降，这一研究结果与之前的报道不一致，可能是由于不同的β-淀粉酶基因、不同的E.coli菌株、不同的酶纯化方法造成的。而本次研究重组β-淀粉酶的热稳定性和比酶活均低于原大麦中纯化的酶，这可能是由于真核来源的蛋白质在原核生物宿主中表达时，其三级结构的折叠以及蛋白的修饰不同造成的。大麦β-淀粉酶是来源于真核生物，通过糖基化修饰后可使其结构更加稳定[17]，而大肠杆菌的表达系统并无糖基化修饰系统，糖基化或许是重组蛋白最适温度与温度稳定性下降的原因。

此外，对纯β-淀粉酶的研究过程中发现，不管是重组表达的β-淀粉酶，还是直接从大麦中纯化的β-淀粉酶，都是一种极不稳定的酶，容易失活。然而在自然状态下，大麦提取的β-淀粉酶酶制剂可以较稳定的保持活性。因此，通过本次纯的β-淀粉酶的比较研究，推测在大麦提取液中存在某些物质，能够保护β-淀粉酶，提高其酶活半衰期，这也可能是植物来源的β-淀粉酶酶制剂具有更好地工业应用效果的原因之一。

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Heterologous expression of β-amylase gene from barley inE.coli

ZHU Pei1,LI Qi2,ZHU Lin-jiang3,HE Peng-yu4,LI Yong-xian1*

1(Lab of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTBarley β-amylase is widely applied in food and brewing industries due to its high activities, good stability and performance. However, the low production rate and high price of barley β-amylase limit its application. In this study, the barley β-amylase was heterologously expressed in Escherich coli. The β-amylase gene was codon-optimized, inserted into plasmid pET28a (+) and over-expressed in E.coli BL21 (DE3) cells. After comparing the recombinant β-amylase with the native one from barley, the results showed that the molecular weight of the recombinant β-amylase was similar with that of the native barley β-amylase, which was about 59 kDa. Its specific activity was decreased to 285.5U/mg, which was lower than that of the enzyme from barley (588 U/mg). Furthermore, its optimum temperature was declined 10 ℃, while its optimum pH kept consistent. Therefore, barley β-amylase gene could be effectively over-expressed in bacterial cells, while its enzymatic properties altered greatly.

Key wordsbarley; β-amylase; heterologous expression; Escherichia coli

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606006

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)；中央高校基本科研业务费资金和江苏高校优势学科建设工程项目

收稿日期：2015-12-09，改回日期：2016-01-20

第一作者：硕士研究生(李永仙为通讯作者,E-mail：yxli@jiangnan.edu.cn)。