rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应的半经验动力学模型

覃小丽, 李道明, 王永华,钟金锋*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)　2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州,510640)



rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应的半经验动力学模型

覃小丽1, 李道明2, 王永华2,钟金锋1*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州,510640)

摘要以大豆油水解反应为模型，考察了缓冲液pH(5.0～7.0)及其添加量(5%～30%)、酶添加量(10～50 U/g)和反应温度(30～50 ℃)对rProROL脂肪酶(recombinant Rhizopus oryzae lipase with prosequence，rProROL)催化大豆油水解的影响，并基于反应条件假设该酶促反应遵循一级反应，建立了酶催化大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反应的半经验动力学模型(Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre)，并通过规划求解得到了不同反应条件下的方程系数。结果显示，通过对比TAG水解率的实验实测值与由动力学方程计算的预测值，两者的相关系数高达0.999 1，验证了该反应符合一级反应；不同反应条件对方程系数(k、Hri、Hre)的影响程度各不同，反映了该酶催化大豆油水解过程中反应速率常数(k)及TAG水解程度的变化规律，为该酶催化大豆油水解过程优化控制提供了直接的数据支持。

关键词rProROL脂肪酶；水解反应；反应速率常数；动力学模型

油脂水解是脂肪酸生产的重要途径。目前，油脂水解的方法主要有高压蒸汽裂解法、化学催化剂催化法和生物酶法。然而，高压蒸汽水解法存在反应温度和压力高(250 ℃，70 bar)、不饱和脂肪酸容易氧化等弱点；化学法对设备要求较高，需要大量的酸对脂肪酸盐进行酸化。因酶法催化反应具有反应条件温和、特异性强、设备要求低、工艺绿色化等优越性，其广泛用于研究油脂改性。酶法催化油脂水解生产脂肪酸成为油脂工业的重要研究方向之一。目前，多种不同来源的脂肪酶被用于催化天然油脂水解制取脂肪酸[1]。近期，Alves等[2]研究显示，单种酶(Novozym 435、Lipozyme TL-IM和Lipozyme RM-IM)催化大豆油水解的水解率(<50%，70 h)较低，但复合酶(80%Lipozyme RM-IM和20% Novozym 435)能够显著提高大豆油的水解率(>80%，24 h)。然而，脂肪酶的生产成本较高和催化效率仍是酶法催化油脂水解工业化生产脂肪酸的技术障碍。因此，对现有脂肪酶的基因序列改造，以获得高产量和优异的催化性质(高活性、高稳定性等)的重组脂肪酶，这对生物酶法改性油脂具有重要意义。米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶广泛用于酯交换反应，但天然酶的表达量少、酶活低。国内外学者在Rhizopusoryzae脂肪酶基因克隆及在不同微生物中表达等方面做了大量研究[3-4]。WANG等[5]构建了Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列与成熟肽基因序列(Rhizopusoryzaelipase with prosequence，ProROL)，并在毕赤酵母(Pichiapastoris)中高效表达，获得高产率的该重组脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)；结果显示该重组脂肪酶对多种油脂(棕榈油、大豆油、菜籽油等)具有较高的水解活性。rProROL在催化醇解反应制备生物柴油中显示较好的稳定性[6]，并可用于催化酸解反应制备结构酯[7-8]。然而，对rProROL脂肪酶在催化油脂水解制备脂肪酸方面的报道较少。

我们的前期研究显示，与Palatase 20000L脂肪酶(通常对催化油脂水解具有良好活性)相比，rProROL脂肪酶对大豆油水解具有更高的活性[9]。因此，本研究以自制rProROL肪肪酶为催化剂、大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反应为模型底物，考察该酶在不同反应条件下催化大豆油水解反应的效果。同时，结合相关实验数据和反应历程推出大豆油水解反应的半经验动力学方程，通过规划拟合求解确定方程的系数，分别探讨各反应条件与方程系数的关系，分析rProROL脂肪酶催化水解大豆油的动态反应历程的变化规律，为rProROL脂肪酶应用于油脂水解生产脂肪酸进行最优化设计提供有益探索和理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

rProROL脂肪酶[Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列与成熟肽基因序列(ProROL)在重组Pichiapastoris中表达，酶活为5480 U/g]：实验室自制[9]；大豆油：嘉里粮油(深圳)有限公司；甘油酯标准品(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)：Sigma-Aldrich中国分公司；异丙醇和正己烷：色谱纯，天津科密欧药品公司。

1.2实验方法

1.2.1rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应

将10 g大豆油与一定质量的具有不同pH值的缓冲液(0.1mol/L NaH2PO4/Na2HPO4)置于50 mL具塞锥形瓶中，充分混合后加入适量rProROL脂肪酶，置于一定温度的水浴振荡器(转速为200 r/min)中反应。定时取样得到的混合物经离心(10 000×g，5 min)后，取上层(油层)用于高效液相色谱分析。

1.2.2水解产物组成分析

取20 μL油相(上层)水解产物于1.5 mL进样瓶中，用1 mL流动相[V(正己烷)∶(异丙醇)∶(甲酸)=15∶1∶0.003]溶解并充分混匀，然后运用高效液相色谱法-示差检测器对其进行组分分离与分析。色谱分析条件主要包括高效液相色谱仪：Waters 1525型；示差检测器：Waters 2414型；色谱柱：Phenomenex Luna Silica(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm particle size)；柱温：35 ℃；流动相：正己烷/异丙醇/甲酸(15∶1∶0.003，体积比)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。通过对比标准样品的保留时间来确定甘油酯及脂肪酸的色谱峰位置；相应组分的保留时间(min)分别为：3.12 (甘油三酯)，3.88(游离脂肪酸)，4.45(1,3-甘油二酯)，5.52 [1,2(2,3)-甘油二酯]，22.44 [1(3)-甘油一酯]，26.93(2-甘油一酯)。采用面积归一化法计算TAG相对含量(质量分数，占总脂质的面积百分比)。根据式(1)计算大豆油TAG的水解率(hydrolysis rate, 记为Hr)：

(1)

式中：TAGi，反应初始时大豆油TAG相对含量，%；TAGt，反应一段时间后反应混合物中TAG相对含量，%。

1.2.3数据统计分析

采用Excel 2010对TAG水解率和TAG相对含量数据进行处理，结果采用平均值±标准差表示。以TAG水解率指标进行反应过程分析，采用最小二乘法(Solver, Microsoft Excel 2010)拟合得到半经验一级动力学模型的参数。

2结果与讨论

2.1rProROL脂肪酶催化大豆油水解过程中水解率动力学方程的建立

本实验中，反应底物(大豆油)和搅拌转速分别固定为10 g和200 r/min，分别考察水解反应体系中缓冲液pH(5.0～7.0)、缓冲液添加量(5%～30%)、酶添加量(10～50 U/g)和反应温度(30～50 ℃)对大豆油水解率的影响，结果如图1所示。由图1可知，各种反应因素对大豆油TAG的水解程度均有不同程度的影响。总体上，不同反应因素对TAG的水解率的变化率在反应4 h内急剧增加，但随着反应时间的延长(>4 h)，TAG水解率的变化程度趋于平缓。

图1　不同反应条件对酶促水解大豆油中TAG水解率的影响Fig.1　Effect of reaction parameters on hydrolysis rate of TAG catalyzed by rProROL

(2)

如式(2)所示，大豆油(TAG)与缓冲溶液(H2O)在rProROL脂肪酶作用下水解成甘油二酯(DAG)、甘油一酯(MAG)和脂肪酸(FA)。在本实验中，缓冲溶液的用量设置为5%～30%(相对于大豆油的质量分数)，在酶促反应过程中TAG浓度大于H2O的浓度。因此，基于TAG水解率的变化趋势(图1)，我们假设本反应中rProROL脂肪酶催化大豆油(TAG)水解反应近似为单底物酶促催化反应过程，假设其遵循一级反应动力学。根据反应动力学的基本原理，TAG水解率方程表示为：

Hr=Hri×(1-e-kt)

(3)

式中：Hr，TAG水解率(实验值)，%；Hri，反应达到平衡状态时TAG水解率(计算值)，%；k，反应速率常数，h-1；t，反应时间，h。

从图1可知，酶促水解反应进行到一段时间后，体系中TAG含量保持基本不变，因此，我们引入一个新的参数——Hre，对方程(3)进行修正，更利于反映实际酶促反应，修正得到的方程(4)为rProROL脂肪酶催化水解反应TAG水解率随时间变化的半经验动力学模型：

Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre

(4)

式中：Hr，TAG水解率(实验值)，%；Hri，反应达平衡状态时TAG的水解率(计算值)，%；Hre，rProROL脂肪酶催化水解在时间t时TAG实际水解率(Hr)与计算值(Hri)的偏差值，%；k，反应速率常数，h-1；t，反应时间，h。

2.2反应动力学方程计算值与实验值的比较与验证

通过分析不同反应条件下TAG水解率的实验数据(图1)，并以此为基础，将不同反应条件的实验数据代入方程(4)进行规划拟合求解，求出相应的方程系数。接着，将相应的动力学系数代入方程(4)计算得到TAG水解率的系列预测值，并对TAG水解率的实验值作图，其关系如图2所示。由图2可知，两者之间的线性相关系数为R2=0.999 1，由此可知，依据半经验动力学模型计算得到的TAG水解率预测值与实验实测值之间具有良好一致性，这也说明了前面假设本反应近似等同于一级反应动力学是合理的，该半经验动力学模型的建立能较好地反映本实验条件范围内rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应过程中TAG水解率的变化规律，表明了建立的半经验动力学模型的可靠性。

图2　TAG水解率的实验测定值与半经验动力学模型计算值之间的比较Fig.2　Comparative results of TAG hydrolysis rate obtained between experimental determination and model prediction

2.3反应条件对rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应过程中TAG水解率的影响

通过上述建立的半经验动力学模型(方程4)，可以有效获取不同反应条件下TAG水解率的预测值，对rProROL脂肪酶催化油脂过程优化控制具有一定的参考意义。该模型的3个方程系数共同决定着TAG水解率的预测值，即为了使rProROL脂肪酶催化大豆油水解程度更高，在考虑反应速率常数的同时，需结合Hri和Hre值。下面探讨不同反应条件对大豆油水解过程TAG含量及动力学方程系数的影响。

2.3.1缓冲液pH对rProROL脂肪酶催化TAG水解反应的影响

不同pH缓冲液对TAG含量的影响如图3a所示。当pH为6.5时，TAG含量在6 h时最低；但随着反应进行到24 h时，pH为7的体系中TAG含量最低，即此时的水解率为最高。这表明具有较高pH值的缓冲液利于rProROL脂肪酶活性的发挥，但随着水解反应的推进，体系中产生的游离脂肪酸可能降低了体系的pH值，因而显示在初始pH为6.5的缓冲液中rProROL脂肪酶在水解反应后期的活性可能受到抑制。然而，很难直观地从图3a中直接评价整体反应快慢程度以及pH对rProROL脂肪酶催化TAG水解率变化程度。因此，我们需要结合半经验动力学方程的系数变化来分析酶促水解反应。

图3　不同pH缓冲液对rProROL 脂肪酶催化大豆油TAG水解反应的影响Fig.3　Effect of buffer pH on rProROL lipase catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反应条件为：大豆油10 g，温度45 ℃，酶添加量30 U/g缓冲溶液2 g)

不同pH缓冲液对rProROL脂肪酶催化TAG水解的影响规律如图3(b)所示。从图3(b)中可知，随着pH的增大，k值变化不大。Hri随着pH增加而先降低后增加，Hre则呈现与Hri相反的变化趋势。由方程(4)可知，欲使rProROL脂肪酶催化大豆油水解程度更高，在考虑反应速率常数的同时，需结合Hri和Hre值以选择合适pH值的缓冲溶液。例如，以反应10 h(因为10 h后TAG含量的变化趋于平缓，图3a)为时间点，根据图3(b)方程系数由方程(4)计算得到的TAG水解率预测值如图3b所示。可见，当pH≥6.5时，TAG水解率预测值较高，这意味着较高pH的缓冲液能够缩短水解反应达到平衡的时间。

2.3.2缓冲液添加量对rProROL脂肪酶催化TAG水解反应的影响

缓冲液添加量对TAG含量变化影响如图4(a)所示。TAG含量随着缓冲液添加量的增加而降低，但当添加量大于20%时，水解反应末阶段的TAG含量差别不大。这意味适量的缓冲溶液有利于促进水解反应，但是达到一定量后，对水解反应的影响则趋于平缓。这可能由于反应体系中缓冲溶液添加量较大时其缓冲能力能够抵消随着反应不断进行产生的游离脂肪酸引起体系的pH值变化，从而能较好地维持脂肪酶的催化活性。

图4　缓冲液添加量对rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反应的影响Fig.4　Effect of buffer content on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反应条件为：大豆油10 g，温度45 ℃，酶添加量30 U/g，缓冲溶液pH 6.5)

图4(b)是缓冲液添加量对动力学方程系数的变化影响示意图。从图4(b)可知，当添加量为5%时，其反应速率常数(k)为0.379 6 h-1；当添加量≥20%时，k值(0.487 8 h-1)达到最大并随后略有下降的趋势。这主要是由于H2O作为反应物之一，适量增加其含量有助于反应向右进行，因而增大了反应速率常数；但过量的缓冲液(>20%)会稀释酶的浓度，从而导致k值有所下降。Hri随着缓冲液添加量增大呈现缓慢下降的趋势，Hre则相反。通过计算TAG水解率的预测值(10 h)可知，较低的缓冲液添加量(5%)对TAG水解率的影响较大，但较高的缓冲液添加量(≥20%)对rProROL催化水解大豆油影响不大。

2.3.3酶添加量对rProROL脂肪酶催化TAG水解反应的影响

酶添加量对rProROL酶促水解大豆油中TAG含量的影响如图5a所示。在反应初始阶段，TAG含量随着酶添加量的增加(从10 U/g增加至50 U/g)呈现显著降低的趋势，这说明增加酶的用量有助于提高水解反应效率。例如，从10 U/g增加至50 U/g时，TAG含量在4 h时分别降低至49.13%和31.17%。但是，随着反应进行到接近平衡时，TAG含量降低程度趋于缓慢，例如，酶添加量从10 U/g增加至50 U/g时，TAG含量在24 h时从28.49%降至25.62%。

图5　酶添加量对rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反应的影响Fig.5　Effect of lipase loading on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反应条件为：大豆油10 g，缓冲溶液(pH 6.5)2 g，温度45 ℃)

酶添加量对动力学方程系数的影响变化趋势如图5b所示。反应速率常数k值随着酶添加量增加呈线性增加的趋势，这与SCHWAAB等[10]报道的动力学速率系数与催化剂(脂肪酶)的用量成正比一致。这说明了增大酶添加量有助于提高rProROL脂肪酶催化反应速率。同时，随着酶添加量的增大，Hri呈现先缓慢下降后快速上升的趋势，而Hre则呈现相反的变化趋势。虽然反应速率常数随着酶添加量的增加而增大，但将这3个方程系数(k、Hri和Hre)带入方程(4)中得到相对应的TAG水解率(10 h)预测值没有明显增大，尤其是酶添加量≥30 U/g时，这说明较高酶用量(≥30 U/g)对rProROL脂肪酶催化大豆油水解反应平衡所需要的时间没有显著影响。

2.3.4反应温度对rProROL脂肪酶催化TAG水解反应的影响

反应温度对rProROL酶促水解反应中TAG含量的影响如图6a所示。当反应温度从30 ℃升高至45 ℃时，TAG含量随着反应进行呈现降低的趋势，这主要由于适当提高温度，可以促进酶活的发挥，有利于水解反应的进行；但温度继续升高至50 ℃时，TAG含量反而较高，这可能由于较高的温度容易使酶蛋白失活，不利于该反应向水解正方向进行，从而导致了TAG的水解程度较低。

图6　反应温度对rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反应的影响Fig.6　Effect of reaction temperature on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG[其他反应条件为：大豆油10 g，酶添加量30 U/g，缓冲溶液(pH 6.5)2 g]

由图6(b)可知，反应速率常数k随着温度的升高而呈现先升高后趋于平缓的变化趋势，这说明升高温度，有利于提高水解反应速率，但当温度超过一定值(>45 ℃)后，k值呈现略有下降的趋势，这主要由于过高的温度造成了酶蛋白变性，酶活力下降，从而影响了酶促水解反应速率。然而，这些变化比较平缓，说明了反应温度对酶促反应速率影响较小。同时，结合Hri和Hre值通过方程(4)计算得到的TAG水解率预测值变化不大，这进一步验证反应温度对rProROL酶促水解大豆油的反应影响较小。

3结论

本文研究了缓冲溶液pH、缓冲溶液添加量、酶添加量、反应温度对rProROL脂肪酶催化水解大豆油过程中水解率的影响。基于本实验条件下得到的大豆油水解率系列数据，从反应的基本原理出发，推导并假设了该反应遵循一级反应半经验动力学。通过规划求解得到大豆油水解率的反应动力学方程[Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre]的各系数值。通过对比大豆油水解率实验测定值与由半经验动力学方程计算得到的预测值，两者的相关系数(R2)为0.999 1，验证了该反应过程符合一级反应动力学方程，并能较好反映该酶促过程中大豆油水解率的变化规律。最后，将方程系数对反应因素作图，得到了反应条件对动力学方程系数的影响程度各不相同，由这些方程系数共同决定TAG含量的预测值。本研究为rProROL脂肪酶催化水解油脂最大化制取游离脂肪酸进行了有益探索。

参考文献

[1]MURTY V R, BHAT J, MUNISWARAN P. Hydrolysis of oils by using immobilized lipase enzyme: a review [J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2002, 7(2): 57-66.

[2]ALVES J S, VIEIRA N S, CUNHA A S, et al. Combi-lipase for heterogeneous substrates: A new approach for hydrolysis of soybean oil using mixtures of biocatalysts [J]. RSC Advances, 2014, 4(14): 6 863-6 868.

[3]LI Z, LI X, WANG Y, et al. Expression and characterization of recombinantRhizopusoryzaelipase for enzymatic biodiesel production [J]. Bioresource Technology, 2011, 102(20): 9 810-9 813.

[4]Di Lorenzo M, Hidalgo A, Haas M, et al. Heterologous production of functional forms ofRhizopusoryzaelipase in Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8 974-8 977.

[5]WANG J R, LI Y Y, XU S D, et al. High-level expression of pro-form lipase fromRhizopusoryzaeinPichiapastorisand its purification and characterization [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 15(1): 203-217.

[6]DUARTE S H, del PESO HERNNDEZ G L, CANET A, et al. Enzymatic biodiesel synthesis from yeast oil using immobilized recombinantRhizopusoryzaelipase [J]. Bioresource Technology, 2015, 183:175-180.

[7]TECEL O C, GUILL N M, VALERO F, et al. Immobilized heterologousRhizopusoryzaelipase: A feasible biocatalyst for the production of human milk fat substitutes [J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 67:104-110.

[8]NUNES P, PIRES-CABRAL P, GUILL N M, et al. Production of MLM-type structured lipids catalyzed by immobilized heterologousRhizopusoryzaelipase [J]. Journal of the American Oil Chemists′ Society, 2011, 88(4): 473-480.

[9]LI D, QIN X, WANG J, et al. Hydrolysis of soybean oil to produce diacylglycerol by a lipase fromRhizopusoryzae[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2015, 115:43-50.

[10]SCHWAAB M, PINTO J C. Optimum reference temperature for reparameterization of the Arrhenius equation. Part 1: Problems involving one kinetic constant [J]. Chemical Engineering Science, 2007, 62(10): 2 750-2 764.

Semi-empirical kinetic model of hydrolysis of soybean oil catalyzed by recombinantRhizopusoryzaelipase

QIN Xiao-li1, LI Dao-ming2, WANG Yong-hua2, ZHONG Jin-feng1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

ABSTRACTSoybean oil was hydrolyzed by using a recombinant Rhizopus oryzae lipase containing prosequence (rProROL), and effect of buffer pH (5.0-7.0), buffer amount (5%-30%), lipase amount (10-50 U/g) and reaction temperature (30-50℃) were investigated. Based on the employed reaction conditions, rProROL-catalyzed hydrolysis was assumed as a first-order reaction, and a semi-empirical kinetic model for the hydrolysis rate (Hr) was established, and the model was presented as follows: Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre. Parameters including reaction rate constant (k), theoretical hydrolysis rate (Hri) and difference value (Hre) related to Hr and Hri were solved using a programming. The results showed that the correlation coefficient between hydrolysis rates of soybean oil obtained from experiments and predicted by the established kinetic model was 0.999 1, which verified that the rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean oil was a first-order reaction and the established model was effective. In addition, reaction rate constant (k), Hre and Hri were affected by various conditions, indicating changes in k and Hr during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by rProROL. These results may provide information for optimization and monitoring of rProROL-catalyzed hydrolysis process.

Key wordsrecombinant Rhizopus oryzae lipase with prosequence (rProROLT1 lipase); hydrolysis; reaction rate constant; kinetic model

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606012

基金项目：中央高校基本业务费专项(XDJK2014B019，XDJK2016b034)；重庆市基础科学与前沿技术研究专项(cstc2015jcyjA80013)；国家自然科学基金(31501446)

收稿日期：2016-02-23，改回日期：2016-03-09

第一作者： 博士，讲师(钟金锋为通讯作者,E-mail：jfzhong@swu.edu.cn)。