贺兰山东麓葡萄酒产区酿酒酵母的分离及其主要特性研究

高晓航，李雪雁，孙春丽

(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州，730050)



贺兰山东麓葡萄酒产区酿酒酵母的分离及其主要特性研究

高晓航，李雪雁*，孙春丽

(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州，730050)

摘要为进一步丰富我国酿酒酵母资源，从贺兰山东麓葡萄酒产区的6个不同品种的成熟期酿酒葡萄果实上分离获得9株野生酿酒酵母，以商业酿酒酵母F15为对照，对分离所得菌株分别进行酒精、SO2、葡萄糖、pH和高渗等耐受性以及β-葡萄糖苷酶活力和果糖利用率影响因素的研究。结果表明，菌株B-1比较适合用于酿造葡萄酒，且β-葡萄糖苷酶主要存在于酿酒酵母细胞外；酿酒酵母的PFK及HK的活性与果糖利用率无相关关系。

关键词酿酒酵母；耐受性；β-葡萄糖苷酶；磷酸果糖激酶；己糖激酶；果糖利用率

酿酒酵母作为葡萄酒发酵过程中最重要的生产菌，直接影响葡萄酒的质量，因此选用适宜的酵母菌对葡萄酒品质尤为重要[1]。β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)作为水解葡萄糖苷的关键酶，能将葡萄中的非挥发性糖苷转化成挥发性物质，提高葡萄酒香气复杂性，改善葡萄酒质量[2]，因此，酵母菌产β-葡萄糖苷酶活力的高低也是其酿酒性能非常重要的特性之一。果糖是葡萄中主要的糖分之一，在葡萄酒酿造过程中，酵母菌会首先分解转化葡萄糖，后分解果糖。有研究表明，发酵中后期葡萄酒中的低葡萄糖果糖比是导致发酵缓慢或停滞的一个重要因素，若果糖不能被有效利用而残留在葡萄酒中，会造成葡萄酒口感失衡，且酒中残糖还会诱发微生物污染。影响果糖利用的因素可能与磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)、己糖激酶(Hexokinase, HK)和转运蛋白有关。

本研究为进一步丰富我国酿酒酵母资源，拟从贺兰山东麓葡萄酒产区分离出较优的野生酿酒酵母，对其进行耐受性以及β-葡萄糖苷酶的研究，以筛选出适合葡萄酒酿造的菌株，并通过测定分离所得野生酿酒酵母的果糖利用率、PFK和HK酶活力，来研究这2种酶的活力与果糖利用率之间的关系。

1材料与方法

1.1材料与试剂

试样：采自于宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的6种成熟期酿酒葡萄果粒，分别为：赤霞珠，西拉，梅鹿辄，霞多丽，蛇龙珠和黑比诺。

商业酿酒酵母菌株F15(Saccharomycescerevisiae)：由兰州理工大学生命科学实验教学示范中心提供。

葡萄汁培养基：鲜榨葡萄汁(10 BX)，琼脂2%，pH 5.0，1×105Pa灭菌20 min；

YPD培养基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%(固体培养基添加琼脂2.0%)，pH 5.0，1×105Pa灭菌20 min；

果糖培养基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，果糖2.0%，1×105Pa灭菌20 min；

WL营养培养基：酵母浸粉0.4%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%，储液A(KH2PO45.5g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，按1/25比例添加)，储液B(FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，按1/1000比例添加)，储液C(0.44 g溴甲酚绿溶于100 mL 50%乙醇溶液中，按0.1%比例添加)，1×105Pa灭菌20 min。

L-谷胱甘肽(还原型谷胱甘肽)(BR)，Triton x-100(RT)，北京博奥拓达科技有限公司；对硝基苯酚(pNP)(AR)，天津市凯信化学工业有限公司；咪唑(AR)，天津市大茂化学试剂厂；对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(BR),南京都莱生物技术有限公司；PFK(磷酸果糖激酶)试剂盒，HK(己糖激酶)试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司；半胱氨酸盐酸盐(BR)，咔唑(CP),上海中秦化学试剂有限公司。

1.2仪器及设备

SW-CJ-1FD型超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；FA2004型分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；DSX-280A型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；UV-3000PC型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；TGL-16型高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1野生酿酒酵母菌株的分离与鉴定

分别从6种成熟整穗葡萄中各摘取优质葡萄50粒，无菌条件破碎后常温放置1 h，各取葡萄汁0.1 mL涂布于葡萄汁培养基上，重复3次，28 ℃培养2 d后，将长出的菌落接种YPD固体培养基上，再次28 ℃培养2 d，将再次长出菌落转接到YPD固体培养基上，划线分离，纯化菌株至纯种。通过形态学鉴定，将从自然发酵醪中分离出的野生酵母菌转接至WL营养培养基划线培养，28℃培养5～10 d，观察菌落颜色和形态，进一步进行分类鉴定。

1.3.2酵母菌株的耐受性试验

以菌株F15作为对照，将筛选出的酵母菌等量(用无菌水配成每毫升含108个细胞数的悬浮液)分别接种于乙醇体积分数(6%、9%、12%、15%、18% vol)、SO2质量浓度(50、100、150、200、250、300 mg/L)、葡萄糖含量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、NaCl质量浓度(60、80、100、120、140、160 g/L)的带杜氏小管的YPD液体培养基(10 mL)试管中，28 ℃培养72 h，观察每支试管中的杜氏小管内是否产生气泡，并记录产生气泡的时间及气泡体积的变化，若产生气泡则耐受该条件，同等条件相同时间气泡体积越大则对该条件耐受性越强。

1.3.3酿酒酵母β-葡萄糖苷酶活性的测定

不同种类酵母菌的β-葡萄糖苷酶在酵母中的分布不同，以菌株F15为对照，测定9株野生酿酒酵母的胞外、壁膜间隙和细胞内β-葡萄糖苷酶的酶活性，酵母菌的β-葡萄糖苷酶是由这3部分酶相加所得。

β-葡萄糖苷酶活性的测定：采用以对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷为酶底物的比色法[3]。β-葡萄糖苷酶的酶活力表示为每小时1 g干重细胞反应生成的对硝基苯酚的量(μmol)。采用王彩肖等[2]的方法制作pNP标准曲线，得方程y=0.008 7x+0.005 0(R2=0.999 4)。

1.3.4果糖利用率的研究

1.3.4.1果糖利用率的测定

采用半胱氨酸-咔唑比色法[5]。采用张晓卿等[5]的方法制作果糖标准曲线，得方程y=0.019 99x+0.01348(R2=0.999 3)。

1.3.4.2磷酸果糖激酶活性的测定

按照PFK试剂盒使用说明书进行操作。酶活力单位的定义：1 g干重细胞1 min催化1 nmol果糖-6-磷酸和1 nmol ATP转化为1 nmol果糖-1,6-二磷酸和1 nmol ADP定义为1个酶活力单位。

1.3.4.3己糖激酶活性的测定

按照HK试剂盒使用说明书进行操作。酶活力单位的定义：1 g干重细胞1 min生成1 nmol NADPH定义为1个酶活力单位。

2结果与分析

2.1野生酿酒酵母菌株的分离与鉴定

从6个不同品种成熟期酿酒葡萄的自然发酵醪中分离出117株酵母菌，通过WL培养基筛选出9株酿酒酵母，分别编号为2-1、2-2、2-3、2-4、A-2、A-5、A-7、A-8和B-1。

2.2酿酒酵母菌株的耐受性分析

2.2.1酒精耐受性

复筛所得9株野生酿酒酵母和对照菌株F15的不同最大耐乙醇体积分数(见图1)比较可知，9株酿酒酵母酒精耐受能力均低于对照菌株。菌株2-3和菌株B-1酒精耐受能力为12%，基本满足酿造葡萄酒的要求，但应用于实际生产还需进一步驯化培育。

图1　不同酿酒酵母的酒精耐受性结果比较Fig.1　Comparison of alcohol tolerance of different S.cerevisiae

2.2.2SO2耐受性

复筛所得9株野生酿酒酵母与对照菌株F15的不同最大耐SO2浓度(见图2)比较表明，菌株B-1耐SO2能力与对照菌株F15相当，可耐受300 mg/L SO2。根据国标GB2760—2011《食品安全国家标准—食品添加剂使用标准》要求葡萄酒中SO2最大使用量250 mg/L，说明菌株B-1完全适应葡萄酒酿造的SO2环境。

图2　不同酿酒酵母的SO2耐受性结果比较Fig.2　Comparison of SO2 tolerance of different S.cerevisiae

2.2.3高糖耐受性

随着葡萄糖质量浓度的升高，杜氏小管内出现气体的时间略有延长。复筛所得9株野生酿酒酵母与对照菌株F15的不同最大耐糖浓度(见图3)比较发现，菌株B-1耐高糖能力与对照菌株相当，葡萄酒酿造过程中酿酒酵母接触的最高糖度一般在30%左右，菌株2-3所能耐受的葡萄糖质量浓度为25%左右，所以菌株B-1和2-3对高糖的耐受性基本能适应葡萄酒酿造的糖度环境。

图3　不同酿酒酵母的高糖耐受性结果比较Fig.3　Comparison of high glucose tolerance of different S.cerevisiae

2.2.4低pH耐受性

随着pH的降低，杜氏小管内产气时间延长，产气量减少。由图4可知，菌株B-1对pH的耐受性相比对照菌株略差，当pH降至2.5时，杜氏小管内没有气体产生，菌株B-1不能生长。与张翠英等[7]报道的酿酒酵母最低生长pH 2.5相比，耐受性略低。一般葡萄汁或葡萄酒pH在3～4，说明菌株B-1和2-3能满足葡萄酒酿造的pH环境。

图4　不同酿酒酵母的低pH耐受性结果比较Fig.4　Comparison of pH tolerance of different S.cerevisiae

2.2.5渗透压耐受性

随着NaCl质量浓度的升高，杜氏小管内气体量递减。由图5可知，菌株B-1对NaCl的耐受性高于对照菌株，菌株B-1在NaCl质量浓度为120 g/L的YPD培养基中仍能生长，高于蒋锡龙等[8]报道的酿酒酵母耐KCl渗透压1.8 mol/L，比薛军侠等[9]报道的个别酿酒酵母耐受2.4 mol/L的KCl低，菌株B-1耐渗透胁迫能力较强，说明菌株B-1完全适应葡萄酒酿造的渗透压环境。菌株2-2耐渗透胁迫能力与对照组相当，说明该菌株也能适应葡萄酒酿造的渗透压环境。

图5　不同酿酒酵母的渗透压耐受性结果比较Fig.5　Comparison of osmoticsterss tolerance of different S.cerevisiae

2.3β-葡萄糖苷酶活性的比较

通过比较不同酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力(见表1)可知，所试酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶主要分布在细胞外，除对照菌株F15外，菌株2-1的β-葡萄糖苷酶活性最高，为175.215 μmolpNP/(g·h)，酶活高于110.00 μmolpNP/(g·h)的菌株还有B-1、A-8、A-5和A-2。菌株2-1胞外酶活最高，为136.799 μmolpNP/(g·h)。结合表1可知，不同野生酿酒酵母发酵上清液中的β-葡萄糖苷酶活性差异显著(P<0.05)。

2.4果糖利用率的研究

2.4.1果糖利用率的测定

由表2可知，商业酵母F15的果糖利用率最高，接近于100%，复筛所得菌株果糖利用率由高到低依次为A-2、2-3、A-7、A-5、A-8、B-1、2-4、2-2和2-1，不同菌株之间果糖利用率差异显著。

表1　不同酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力

注：数据后标注不同小写字母表示多重比较差异显著(P<0.05)，下同。

表2　不同酿酒酵母的PFK与HK酶活力以及果糖利用率

2.4.2PFK及HK酶活性的比较

由表2可知，菌株2-3的PFK酶活性最高，对照菌株F15最低，不同酿酒酵母之间PFK酶活性差异显著。菌株2-3的HK酶活性最高，菌株A-2最低，不同菌株之间HK酶活性差异显著。

3结论

本试验通过从宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的6种成熟期酿酒葡萄果粒分离获得了9株野生酿酒酵母，通过对这9株酿酒酵母进行耐受性分析以及β-葡萄糖苷酶活力的测定，得知酿酒酵母β-葡萄糖苷酶主要位于细胞外，除对照菌株F15外，酶活性高于110.00 μmol pNP/(g·h)的菌株依次是2-1、B-1、A-8、A-5和A-2。综合分析，菌株B-1耐受性各项指标均能满足酿造葡萄酒的基本要求，且β-葡萄糖苷酶活性也较高。通过对各菌株果糖利用率、PFK和HK酶活力的测定和比较，结果表明酿酒酵母的PFK及HK的活性与果糖利用率无相关关系。

目前，国内外有关酿酒酵母果糖利用率的研究报道较少，本试验从PFK和HK两个酶的酶活性着手研究，补充了当前酿酒酵母果糖利用率的研究空白，结果证明了PFK和HK酶活性与酿酒酵母果糖利用率无相关关系。因此，为进一步探索影响酿酒酵母果糖利用率的机理，还需从其他可能的影响因子上进行更深一步的研究。

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The isolation and main characteristics ofSaccharomycescerevisiaein East Helan mountain wine-producing regions

GAO Xiao-hang, LI Xue-yan*, SUN Chun-li

(School of life science and engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

ABSTRACTIn order to further enrich the resources of wild Saccharomyces cerevisiae in China, 9 yeast strains were isolated from 6 different varieties of mature wine grape fruits in East Helan mountain wine-producing areas. The tolerance (alcohol, SO2, glucose, pH and high osmotic pressure, etc.), β-glucosidase enzyme activity and fructose utilization of the 9 wild wine yeasts were studied using the commercial strain F15 as control. The results showed that the strain B-1 was suitable for brewing wine, and the β-glucosidase mainly existed in the extracellular fluid of S.cerevisiae. The activity of PFK and HK in S.cerevisiae was not correlated with the utilization of fructose.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; tolerance; β-glucosidase; phosphofructokinase; hexokinase; fructose utilization rate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606011

收稿日期：2016-01-07，改回日期：2016-02-18

第一作者：硕士研究生(李雪雁教授为通讯作者,E-mail：llglixueyan@163.com)。