HPLC/MS定性定量检测清脑保心康胶囊中非法添加的氢氯噻嗪

□ 朱 敏 叶丹怡 上海市金山食品药品检验所



HPLC/MS定性定量检测清脑保心康胶囊中非法添加的氢氯噻嗪

□ 朱 敏 叶丹怡 上海市金山食品药品检验所

摘 要：目的：建立HPLC/MS方法，快速定性定量检测保健食品中非法添加的氢氯噻嗪。方法：采用高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测。色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱。柱温：30℃。流动相：甲醇：0.1%甲酸水溶液=80：20。流速为0.5 mL/min。质谱条件：ESI源，多反应监测（MRM）。以保留时间及定性离子对之间的相对丰度定性，以定量离子对峰面积定量。结果：氢氯噻嗪在10.29～1 028.79 ng/mL范围内呈现良好的线性关系（r＞0.999 7）。平均加样回收率：99.12%。定量限为10.29 ng。结论：本方法定性可靠、定量准确，且快速简便。可用于保健食品中非法添加氢氯噻嗪的检验。

关键词：HPLC/MS；清脑保心康胶囊；氢氯噻嗪

氢氯噻嗪为利尿、抗高血压药。对肝原性水肿、心原性水肿、肾性水肿有一定的治疗效果，例如：急性肾小球肾炎、肾上腺皮质激素、慢性肾功能衰竭以及雌激素过多导致的水肿，高血压，尿崩症；胆囊炎、胰腺炎、性功能减退、光敏感、色觉障碍等较为罕见。长期服用本药品可能出现的不良反应：浑身无力、疲倦、头晕、食欲下降、反胃呕吐、腹泻、血压降低等不适的症状，减少药品的用量或者适量调节电解质失衡后不适症状会马上减退。有一部分违法的商人，在一部分声称有降低高血压作用的保健食品中非法添加化学药品，因为在增添化学药物的用量上不明确，导致一部分患者在毫不知情的情况下服用。无意中增加了风险性，造成不良反应，严重的更是威胁患者的生命［1］。因此，急需对此类非法添加行为进行检验检测，严厉打击。之前已有不少研究者用不同的仪器监测中成药制剂中添加降压药物。此保健品已报道的只有樊磊磊 等定量检测非法添加物利血平，他们怀疑其中不止混有利血平，还有其他降压化学药品。本文采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，检测出其还混有氢氯噻嗪，并首次进行定量定性同步检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（Agilent 6460 安捷伦公司）；色谱柱Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm） （安捷伦公司）；滤膜0.8μm（上海半岛实业有限公司净化器材厂）；SK5210HO超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；BT124S电子分析天平（北京赛多利斯公司）；BP211 D电子分析天平（北京赛多利斯公司）。

氢氯噻嗪对照品（供含量测定用，含量为99.4%批号：100309-201103中国药品生物制品检定所），清脑保心康胶囊（国药准字Z20002158 药品安全专项整治行动送检样品）；甲醇均为色谱纯（Merck公司），水为超纯水。

1.2 HPLC/MS条件

1.2.1 HPLC条件

色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），柱温：30℃，进样量：2 μL，甲醇：0.1%甲酸水溶液=80∶20；流速：0.5 mL/min。

1.2.2 MS条件

ESI源（-），毛细管电压：3.5 kV，离子源温度：100℃，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10 L/min，雾化器压力：50 psi。监测方式：MRM，监测离子对（m/z）：295.5＞269.0；295.5＞205.1；295.5＞78.0。

1.3 对照品溶液的制备

在避免光线的条件下，严格称量氢氯噻嗪标准对照品10.35 mg，置100 m L棕色容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，制成102.88 ug/mL的标准储备液（1），再精密吸取1.0 mL至100 m L棕色容量瓶中，加甲醇定量稀释制成浓度为1.028 8 ug/mL的标准贮备液（2），2～8℃冷藏保存，备用。

1.4 供试品溶液的制备

避光条件下，先取适量的样品内容物，将其混合搅拌，均匀后再取一次性服用量样品，对其精确称量，然后放入50 mL的容量瓶中，再添加40 m L的甲醇，冷却至室温后，用甲醇稀释至刻度，轻摇至均匀，再次稀释50倍后，过0.8 μm微孔滤膜，便可得到［2］。

1.5 空白溶液制备

直接取稀释溶剂即得。

2 结果

2.1 定性分析

取标准贮备液（2），稀释制成51.439 5 ng/mL的对照品溶液，进样2 μ L，准确记录下所得到的质谱MRM色谱图。记录、对比解析对照品溶液所得图谱中氢氯噻嗪的色谱保存时间（RT=1.89 min）及定性离子碎片存在有（m/z：295.5＞269.0；295.5＞205.1；295.5＞78.0）。

取供试品溶液，进样2 μ L，记录得到的质谱MRM色谱图。记录、对比解析供试品溶液的图谱，比如：检测氢氯噻嗪的质谱MRM离子通道中有色谱峰出现，先与对照品中峰的保留时间对比（供试品峰RT=1.89 min的±2.5%允许误差范围内），此一致，再对比定性离子碎片是否跟对照品一致，也一致，则判断供试品溶液中含有此化学药品。

2.2 定量分析

对判定供试品溶液中含有氢氯噻嗪的供试品，则按其定量离子对（m/z）：347.1＞269.0的峰面积进行含量计算。含量测定方法研究如下。

线性观察和定量限配制系列浓度的对照品溶液，进行样品的测定，以浓度为横坐标，纵坐标是离子对的峰面积，对其进行线性回归。结果显示，在10.2 879～1 0 28.79 ng/mL范围内，氢氯噻嗪的线性方程式为：Y=2.664 247X+18.077 545 （r=0.999 7），进样量是2 μL，其线性关系良好，氢氯噻嗪的定量限为10.287 9 ng。

精密度试验取对照品溶液1份，连续进样6次，氢氯噻嗪定量离子对峰面积的RSD为0.94%。

取阳性样品6份，反复进行试验，按照供试品的制备方法制备，逐次测定样品。氢氯噻嗪中含有RSD0.86%。

稳定性试验：取上述反复的试验所得到的同一样品溶液，区分在2、4、8、16 h，进行样品的测定，结果氢氯噻嗪的峰面积RSD为1.45%。结果显示，制备后16 h内，供试品溶液的稳定性良好。

回收率试验：取一次性服用量的阳性样品6份，分别放置于50 mL的容量瓶中，每个容量瓶都加入以102.88 μg/mL为标准的贮备液（1）5 mL，将其用超声处理15 min，再冷却到室温，然后用甲醇稀释至刻度，摇至均匀，稀释50倍后，过0.8 μm微孔滤膜，进行测定。平均回收率为99.77%，RSD 为0.12%。见表1。

表1 回收率结果

（6）样品测定：取一定的样品溶液，进行测定，以监测到的MRM色谱图中定量离子对（m/z）：347.1＞269.0的峰面积进行计算，氢氯噻嗪含量为：0.54 mg/g。

3 结语

清脑保心康胶囊具有降压功效，其以纯中药制剂保健品的形式，违法增添化学药品氢氯噻嗪进行出售，胶囊中所含成分繁杂，掺杂着许多干扰成分，不利于一般检测措施的实施。而使用串联四级杆质谱MRM检测措施，有更好的选择性，还能有效消除其他的干扰成分，不需要对样品进行繁杂的前处理，减少了因前处理而增加的误差，采取相对保留时间及离子碎片进行定性，定性结果更为准确，且灵敏度也极高。采用HPLC分析样品，在3 min内即可完成样品的检测，把两种方法相互结合使用可使快速的定性定量检测得以快速实现。综上所述，HPLC/MS法效果显然比简单的HPLC法效果更好［3］。

参考文献：

［1］周兰坤.谈降压药物的不良反应［J］.中外医疗，2009，28（15）：90.

［2］刘吉金.降压保健品及中成药中非法添加化学成分的快速检测方法研究［J］.中成药，2008，30（1）：144-146.

［3］刘吉金，杨敏，李军，等.HPLC同时检测保健品及中成药中非法添加9种抗高血压化学药物的研究［J］.中国现在应用药学，2008，25（z2）：717-719.

作者简介：朱敏（1987-），男，汉，上海金山人，本科，助理工程师。研究方向：食品药品检测。叶丹怡（1982-），女，汉，上海金山人，本科，助理工程师。研究方向：食品药品检测。