胆囊癌组织中Cyr61和β-catenin的表达及临床意义

霍雄伟，尚元春，魏光兵，孙学军，高燕凤

(1. 西安交通大学第一附属医院普通外科，陕西西安　710061；2. 绥德县人民医院，陕西绥德　718099；3. 西安交通大学第一附属医院麻醉科，陕西西安　710061)



◇临床研究◇

胆囊癌组织中Cyr61和β-catenin的表达及临床意义

霍雄伟1，尚元春2，魏光兵1，孙学军1，高燕凤3

(1. 西安交通大学第一附属医院普通外科，陕西西安710061；2. 绥德县人民医院，陕西绥德718099；3. 西安交通大学第一附属医院麻醉科，陕西西安710061)

摘要：目的研究Cyr61、β-catenin在胆囊癌组织及癌旁正常组织中的表达差异及相关性，探讨其在胆囊癌发生发展过程中的作用。方法应用免疫组织化学SP法，检测50例胆囊癌组织及19例癌旁正常组织中Cyr61和β-catenin蛋白的表达，并与其临床病理特征进行比较分析。结果①Cyr61在胆囊癌组织中的阳性表达率为66.0% (33/50)，明显高于正常组织中的26.3%(5/19)(P<0.05)；Cyr61的表达与胆囊癌的肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P=0.010、P=0.014、P=0.007，P<0.05)；②β-catenin在胆囊癌组织中的阳性表达率为84.0%(42/50)，明显高于正常组织中的15.7%(3/19)(P<0.05)；β-catenin的表达与胆囊癌的肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P=0.018、P=0.002、P=0.024，P<0.05)；③相关性检验显示，Cyr61和β-catenin在胆囊癌组织和癌旁正常组织中呈正相关(r=0.378，P<0.05)。结论Cyr61和β-catenin在胆囊癌组织中存在显著高水平表达；Cyr61和β-catenin阳性表达与胆囊癌患者的临床病理特征(肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移)密切相关；两者在胆囊癌的发生发展过程中可能有协同促进作用，联合检测这两种蛋白的表达对胆囊癌的临床诊断及预后判断有一定的指导意义。

关键词：胆囊癌；免疫组织化学；Cyr61；β-catenin；临床病理特征

胆囊癌是常见的消化道肿瘤之一。由于其特殊的解剖位置和发病隐匿的特点，早期诊断困难，大多数患者就诊时已经是中晚期，通常已经发生转移，手术机会少，临床治疗效果很差，大部分患者在确诊后1年内死亡[1]。由于肿瘤的生物学异质性，仅依靠临床病理分期来评估预后有一定的局限性。胆囊癌的发生发展具体机制尚不清楚，但较为明确的是，该疾病是一个多基因参与调节的过程。近年来，随着对胆囊癌发病机制研究的不断深入，能从分子水平开始认识肿瘤的发生发展过程，为胆囊癌的早期诊断及分子靶向治疗带来了新的机遇。因此,寻找参与胆囊癌发生发展的重要分子并进一步探索其参与胆囊癌发生发展的机制，对提高胆囊癌的早期诊断水平、改善患者的预后具有重要意义。

富含半胱氨酸61(cysteine-rich 61, Cyr61, CCN1)是一种分泌性基质蛋白，是即刻早反应基因(immediate early gene, CCN)家族成员中第1个被克隆的基因，在恶性肿瘤中，Cyr61基因主要参与肿瘤的增殖迁移、生长调节和血管形成[2]。β-catenin是当今研究最多的一种连环蛋白(catenin)，是重要的细胞骨架成分及细胞黏附因子，同时也是Wnt信号通路中的关键组成部分；β-catenin在肿瘤细胞中主要起到促进细胞增殖、抑制凋亡的作用[3]。Cyr61和β-catenin在胆囊癌发生发展中的作用目前尚未明确，两者在胆囊癌中的联合检测尚未见报道。本研究应用免疫组化方法检测50例胆囊癌组织及19例癌旁正常组织中Cyr61和β-catenin蛋白的表达，并结合其临床病理特征，进一步分析Cyr61和β-catenin在胆囊癌组织中的表达与临床病理的相关性，探讨两者参与胆囊癌发生发展的分子信号机制。

1材料与方法

1.1标本来源选取2007年12月至2015年1月在西安交通大学第一附属医院病理科保存的手术治疗的胆囊癌标本50例，其中全部为腺癌，乳头状腺癌8例，黏液样腺癌10例，硬化性腺癌32例；高分化腺癌30例，中低分化腺癌20例。男20例，女30例，年龄41～89岁，平均61岁。淋巴转移19例，无淋巴转移31例。胆囊癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期为16例，Ⅲ～Ⅳ期为34例。所有的患者术前均未接受放疗和化疗，术后病理诊断均证实为胆囊癌。另选取癌旁正常组织标本19例，男7例，女12例。胆囊癌组织学分类依据世界卫生组织WHO 2000年病理分型标准，并由2名经验丰富的病理医生阅片证实。所有标本用40 mL/L中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，严格控制条件下作5 μm连续切片，链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法免疫组织化学染色，同时行HE染色作为病理分期等的参照。

1.2主要试剂兔抗人Cyr61多克隆抗体(bs-1290R)和兔抗人β-catenin多克隆抗体(bs1165R)均购自北京博奥森生物技术开发有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(bse-0295G)购自北京中杉生物科技有限公司；免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组化法检测胆囊癌及癌旁组织Cyr61和β-catenin表达石蜡切片，常规脱蜡，30 mL/L H2O2去离子水灭活内源性过氧化物酶活性，98 ℃微波抗原修复15 min，血清封闭，室温20 min；一抗(1∶150)稀释，4 ℃孵育过夜；生物素标记的二抗37 ℃孵育30 min，链霉亲和素-过氧化物酶室温1 h，DAB显色剂显色4 min，苏木素复染2 min，脱水，透明，封片观察。染色时，设置阴性对照组，即利用PBS代替一抗。

1.4免疫组化结果的判定免疫组织化学染色结果由我院病理科2位医师以双盲法分别进行评测。每例取1张切片按常规行HE染色，光镜下进行病理分级，并与免疫组化结果相对应观察。Cyr61主要表达于细胞质内，也有表达于胞核内或细胞膜的标本，染色呈淡黄色、黄色，细胞核中染色呈深褐色；β-catenin在正常组织中主要表达于细胞膜，在癌组织中细胞膜染色减弱或染色不连续，而在胞质和(或)胞核中染色增强。每张切片在400倍视野下随机观察5个视野，对着色细胞进行计数，计算着色细胞所占百分比。Cyr61阳性标准：阴性(-)：细胞胞质、胞核不显色；弱阳性(+)：25%～50%的细胞胞质、胞核呈阳性染色；阳性()：51%～75%的细胞胞质、胞核呈阳性染色；强阳性()：>75%的细胞胞质、胞核呈阳性染色；将(-)记为阴性标本，(+)、()及()定为阳性标本。β-catenin阳性标准：高倍镜下(×400)观察5个视野，每个视野观察100个细胞，计算每张切片阳性细胞百分率，小于10%的为阴性(-)，大于10%的为阳性(+)[4-5]。

1.5统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。Cyr61和β-catenin的表达情况与胆囊癌临床病理特征采用χ2检验或Fisher确切概率法，关联性分析采用两种属性独立的χ2检验并计算Pearson列联系数来表示关联程度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Cyr61和β-catenin在胆囊癌和癌旁正常组织中的表达Cyr61主要表达于胞质内，也可表达于胞核或细胞膜，染色呈淡黄色、黄色，胞核中染色呈深褐色(图1)。Cyr61在胆囊癌癌旁正常组织阳性表达率为26.3%，而在胆囊癌组织中阳性表达率为66.0%，差异有统计学意义(χ2=13.92，P<0.05，表1)。β-catenin在正常组织中主要表达于细胞膜，在癌组织中细胞膜染色减弱或染色不连续，而在胞质和(或)胞核中染色增强(图1)。β-catenin在胆囊癌癌旁正常组织阳性表达率为15.7%，而在胆囊癌中表达明显，阳性表达率为84.0%，差异有统计学意义(χ2=28.24，P<0.05，表1)。

图1Cyr61和β-catenin在胆囊癌及癌旁组织中的表达

Fig.1 Expressions of Cyr61 and β-catenin protein in gallbladder carcinoma tissues and adjacent normal tissues (×400)

A：Cyr61在癌旁组织中阴性表达；B：Cyr61在癌旁组织中阳性表达；C：Cyr61在胆囊癌组织中阴性表达；D：Cyr61在胆囊癌组织中阳性表达；E：β-catenin在癌旁组织中阴性表达；F：β-catenin在癌旁组织中阳性表达；G：β-catenin在胆囊癌组织中阴性表达；H：β-catenin在胆囊癌组织中阳性表达。

表1Cyr61和β-catenin蛋白在胆囊癌组织与癌旁正常组织中的表达比较

Tab.1Expressions of Cyr61 and β-catenin protein in gallbladder carcinoma tissues and adjacent normal tissues

组织来源例数Cyr61表达阳性阴性阳性率(%)χ2Pβ-catenin表达阳性阴性阳性率(%)χ2P癌旁组织1951426.3胆囊癌组织50331766.013.930.00131615.742884.028.240.001

2.2Cyr61和β-catenin表达与胆囊癌临床病理特征的关系胆囊癌组织中Cyr61的表达与肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移有显著相关性(P=0.010、P=0.014、P=0.007，P<0.05)，而与患者性别、年龄、组织类型以及是否合并胆结石无显著相关性(P>0.05)。β-catenin的阳性表达与胆囊癌的肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移有显著相关性(P=0.018、P=0.002、P=0.024，P<0.05),而与患者性别年龄、组织类型以及是否合并胆结石无显著相关性(P>0.05，表2)。

2.3Cyr61和β-catenin在胆囊癌组织中表达的相关性Cyr61、β-catenin均为阳性31例，两者均为阴性6例，表达一致率为74.0%(37/50)。两者表达的关联性分析，χ2=7.134，P<0.05，可以认为胆囊癌组织中Cyr61和β-catenin表达具有一定的关联性，Pearson列联系数r=0.378(表3)。

3讨论

胆囊癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，具有早期诊断困难和治疗效果差的特点。胆囊癌发生、发展的分子机制复杂，涉及众多癌基因及抑癌基因的表达改变以及多种调控机制的共存，已成为胆囊癌治疗领域中新的热点。所以说，找到胆囊癌发生发展的关键基因和相应的蛋白产物，将有助于胆囊癌的早期诊断，并对胆囊癌发病机制的研究及靶向治疗提供新的依据。

作为分泌蛋白CCN家族的成员之一，Cyr61主要在细胞质中表达，在胞核和细胞膜上也有表达。Cyr61处于细胞内外信号转导通路下游，作为重要的细胞基质调节因子，其参与多个细胞转导通路的调节；在肿瘤发生发展过程，Cyr61主要参与肿瘤的增殖迁移、生长调节和血管形成。经临床试验证实，Cyr61作为重要的细胞调节因子，在多种恶性肿瘤发生发展过程中，参与了肿瘤的生长及转移，例如肺癌、神经胶质细胞瘤[6]、前列腺癌[7]、胰腺癌[8-9]和乳腺癌[10]。在不同的恶性肿瘤中，Cyr61产生不同的生物学活性，如细胞生长、细胞迁移和细胞增殖等。同时，在不同恶性肿瘤中Cyr61的表达水平也不尽相同，如在前列腺癌、子宫内膜癌[11]、平滑肌瘤、甲状腺癌和非小细胞肺癌[12]中，Cyr61表达水平较低，呈现为生长抑制因子；而在晚期乳腺癌中Cyr61作为血管生成因子而高水平表达。Cyr61还可以调节癌基因表达，在非小细胞肺癌中，Cyr61通过影响c-myc基因和Prb2/p130的表达，促进细胞的凋亡[13]。由于Cyr61可以与多种不同的整合蛋白结合，故可以通过不同的细胞信号通路发挥不同的调节作用，如NF-κB传导通路、酪氨酸激酶途径、Wnt信号传导通路和Akt信号传导通路[14]。总之，在不同肿瘤组织中，Cyr61发挥不同的生物学作用。然而，在胆囊癌组织中Cyr61的生物学功能尚不明确。本研究结果表明，Cyr61在胆囊癌组织中存在显著高表达，Cyr61的阳性表达与胆囊癌分化程度、有无淋巴结转移及TNM分期有显著相关性，提示Cyr61在胆囊癌的发生发展过程中可能起到重要作用。但其具体作用机制尚不十分明确，还需进一步的研究。

表2Cyr61蛋白和β-catenin蛋白表达与胆囊癌临床病理特征之间的关系

Tab.2Expressions of Cyr61 and β-catenin protein and their relationship with clinicopathologic features of gallbladder carcinoma

临床病理特征例数Cyr61表达阳性阴性χ2Pβ-catenin表达阳性阴性χ2P性别2.2110.137〛0.1750.676 男20137155 女30255246年龄0.7090.400〛0.6000.277 ≥5027216225 <5023203203组织类型2.4430.295〛2.6880.261 硬化性32266275 乳头状85362 黏液性106464病理分化6.5970.010〛5.6140.018 高分化3019112010 中低分化20191191TNM分期6.0360.014〛9.2350.002 Ⅰ～Ⅱ期1587105 Ⅲ～Ⅳ期35305341淋巴转移7.3470.007〛5.1090.024 有21201192 无2918111811胆囊结石0.6400.424〛0.2730.602 合并26188233 非合并24195204

表3Cyr61和β-catenin在胆囊癌组织中表达的相关性

Tab.3Correlation between the expressions of Cyr61 and β-catenin in gallbladder carcinoma

Cyr61β-catenin+-合计χ2Pr+-31112633177.134<0.050.378合计42850

β-catenin基因编码的β-catenin蛋白是Wnt信号通道中的主要蛋白，同时也是E-钙黏素(E-cadherin)介导的细胞间粘附复合体E-cad/catenin的胞内关键组成部分，参与细胞的粘附作用。同时细胞质内异常表达的β-catenin可以使基质金属蛋白酶-7(MMP-7)和波形蛋白基因的激活，使细胞外基质降解，为肿瘤细胞的转移创造条件[15]。β-catenin在不同的恶性肿瘤中表达水平不一，发挥的作用不尽相同。在正常甲状腺组织中，β-catenin主要表达在细胞膜上，但在甲状腺癌中主要在细胞核或胞质内表达，细胞膜表达减少或缺失[16]。在正常乳腺组织中，β-catenin表达于细胞膜，而在乳腺癌组织中则主要表达在胞质和细胞核内[17]。肖建等[18]发现，β-catenin在食管鳞癌中胞膜表达减少或缺失，在胞质、胞核异常表达，与TNM分期、分化程度、是否伴发淋巴结转移相关，且肿瘤分化程度低、淋巴结转移者较分化程度高、不伴淋巴结转移者表达高；提示β-catenin异常表达可能参与了食管鳞癌的发展。本研究结果表明，β-catenin蛋白在胆囊癌组织中存在异常高表达，且其高表达与TNM分期、分化程度、是否发生淋巴结转移有显著相关性；提示β-catenin在胆囊癌的发生发展过程中可能起到一定作用。

近年来，LI等[19]发现，Cyr61和β-catenin在肝细胞肝癌中的表达具有相关性，且β-catenin通过结合Cyr61启动子区域的TCF4结合元件激活Cyr61的转录和表达，进而促进肝癌细胞的增殖，从而促进肝细胞肝癌的发生发展。该研究提示β-catenin可能是Cyr61在肿瘤组织中异常高表达的重要原因；同时β-catenin可能通过上调Cyr61表达进而调控肿瘤的发生发展。为进一步证实这一推测是否发生在胆囊癌中，本研究对Cyr61和β-catenin在胆囊癌中表达的相关性进行进一步分析。结果表明，Cyr61和β-catenin蛋白在胆囊癌组织中表达具有明显的相关性。β-catenin可能通过上调Cyr61的表达，参与胆囊癌生物学行为的形成；同时，联合检测Cyr61和β-catenin蛋白表达水平有助于预测胆囊癌的生物学特性及患者预后。然而，Cyr61和β-catenin在胆囊癌中的具体分子学机制仍不清楚，有待于后续工作的进一步阐明。本研究通过检测Cyr61和β-catenin蛋白在胆囊癌组织中的表达水平，将有助于胆囊癌生物学行为形成原因的分子学水平阐述，对胆囊癌基因治疗的发展提供新的可选基因，并有助于胆囊癌患者预后的判断。

参考文献：

[1] RAKIC M, PATRLJ L, KOPLJAR M, et al. Gallbladder cancer[J]. Hepatobiliary Surg Nutr, 2014, 3(5):221-226.

[2] LAU LF. CCN1/CYR61: the very model of a modern matricellular protein[J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(19):3149-3163.

[3] LIU F, MILLAR SE. Wnt/{beta}-catenin signaling in oral tissue development and disease[J]. J Dent Res, 2010, 89(4):318-330.

[4] 刘丽娜，李瑶，杨永秀，等. MCM5和P16INK4A在宫颈鳞癌组织中的表达及其临床意义[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2015, 36(6):829-835.

[5] 张正良，车向明，白郑海，等. FOXA1和YAP在胃癌中的表达及临床意义[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2015, 36(5):667-671.

[6] CHENG G, ZHANG H, ZHANG L, et al. Cyr61 promotes growth of glioblastomainvitroandinvivo[J]. Tumour Biol, 2015, 36(4):2869-2873.

[7] LEE YJ, LEE DM, LEE SH. Production of Cyr61 protein is modulated by extracellular acidification and PI3K/Akt signaling in prostate carcinoma PC-3 cells[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 58:169-176.

[8] HAQUE I, DE A, MAJUMDER M, et al. The matricellular protein CCN1/Cyr61 Is a critical regulator of sonic hedgehog in pancreatic carcinogenesis[J]. J Biol Chem, 2012, 287(46):38569-38579.

[9] HUANG YT, LAN Q, PONSONNET L, et al. The matricellular protein CYR61 interferes with normal pancreatic islets architecture and promotes pancreatic neuroendocrine tumor progression[J]. Oncotarget, 2016, 7(2):1663-1674.

[10] HARRIS LG, PANNELL LK, SINGH S, et al. Increased vascularity and spontaneous metastasis of breast cancer by hedgehog signaling mediated upregulation of Cyr61[J]. Oncogene, 2011, 31(28):3370-3380.

[11] WATARI H, XIONG Y, HASSAN MK, et al. Cyr61, a member of ccn (connective tissue growth factor/cysteine-rich 61/nephroblastoma overexpressed) family, predicts survival of patients with endometrial cancer of endometrioid subtype[J]. Gynecol Oncol, 2009, 112(1):229-234.

[12] LV J, ZOU Y, ZHANG C, et al. Expressions of Cyr61 and WISP-3 in non-small cell lung cancer and its clinical significance[J]. Chin J Lung Cancer, 2010, 13(12):1122-1126.

[13] JANDOVA J, BEYER TE, MEUILLET EJ, et al. The matrix protein CCN1/CYR61 is required for alpha(V)beta5-mediated cancer cell migration[J]. Cell Biochem Funct, 2012, 30(8):687-695.

[14] LAU LF. CCN1/CYR61: the very model of a modern matricellular protein[J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(19):3149-3163.

[15] WU Q, YANG Y, WU S, et al. Evaluation of the correlation of KAI1/CD82, CD44, MMP7 and beta-catenin in the prediction of prognosis and metastasis in colorectal carcinoma[J]. Diagn Pathol, 2015, 10:176.

[16] ZHANG J, GILL AJ, ISSACS JD, et al. The Wnt/beta-catenin pathway drives increased cyclin D1 levels in lymph node metastasis in papillary thyroid cancer[J]. Hum Pathol, 2012, 43(7):1044-1050.

[17] KING TD, SUTO MJ, LI Y. The Wnt/beta-catenin signaling pathway: a potential therapeutic target in the treatment of triple negative breast cancer[J]. J Cell Biochem, 2012, 113(1):13-18.

[18] 肖建，时宝忆，王丹，等. β-catenin和wnt-1在食管癌组织中的表达及其临床意义[J]. 标记免疫分析与临床, 2010, 17(1):1-4.

[19] LI ZQ, DING W, SUN SJ, et al. Cyr61/CCN1 is regulated by Wnt/beta-catenin signaling and plays an important role in the progression of hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One, 2012, 7(4):e35754.

(编辑卓选鹏)

收稿日期：2016-01-14修回日期：2016-04-22

基金项目：陕西省科技攻关项目(No.S2012SF2512)

通讯作者：孙学军. E-mail: sunxy@mail.xjtu.edu.cn；高燕凤. E-mail: gaoyf2009@126.com

中图分类号：R735.8

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604020

Expressions and clinical significance of Cyr61 and β-catenin in gallbladder carcinoma

HUO Xiong-wei1, SHANG Yuan-chun2, WEI Guang-bing3, SUN Xue-jun4, GAO Yan-feng5

(1. Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061; 2. People’s Hospital of Suide County, Suide 718099; 3. Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo evaluate the expressions of Cyr61 and β-catenin protein in gallbladder carcinoma tissues and investigate their association with the clinicopathologic features of gallbladder carcinoma patients. MethodsThe expressions of Cyr61 and β-catenin protein in 50 cases of gallbladder carcinoma and 19 cases of normal tissue were detected by immunohistochemical S-P method. Results① The positive expression rate of Cyr61 in gallbladder carcinoma tissues was 66.0% (33/50), which was significantly higher than that in the normal tissues group (26.3%). The expression of Cyr61 was related to tumor differentiation, TNM stage and lymph node metastasis of gallbladder carcinoma (P=0.010, P=0.014, P=0.007; P<0.05). ② The positive expression rate of β-catenin in gallbladder carcinoma tissues was 84.0% (42/50), which was significantly higher than that in the normal tissues group 15.7% (3/19); the expression of β-catenin was related to tumor differentiation, TNM stage and lymph node metastasis of gallbladder carcinoma (P=0.018, P=0.002, P=0.024; P<0.05). ③ Correlation test showed that Cyr61 and β-catenin were positively correlated in gallbladder carcinoma and adjacent normal tissues (r=0.378, P<0.05). ConclusionCyr61 and β-catenin are highly expressed in gallbladder carcinoma tissues. Cyr61 and β-catenin expressions are closely related to the clinicopathologic features (tumor differentiation, TNM staging and lymph node metastasis) in gallbladder carcinoma. Cyr61 and β-catenin may have a synergistic effect in promoting progression and development of gallbladder carcinoma. Combined detection of Cyr61 and β-catenin in gallbladder carcinoma tissues will contribute to the clinical diagnosis and prognosis.

KEY WORDS:gallbladder carcinoma; immunohistochemistry; Cyr61; β-catenin; clinicopathologic feature

Supported by the Science and Technology Foundation of Shaanxi Province (No.S2012SF2512)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.0902.010.html(2016-06-15)