低氧诱导因子在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达及其与糖调节蛋白78的关系

李旭炯，张慧英，田小霞，陈云霞，孟　莉，来丽娜，赵中夫，韩德五，Cheng Ji

(长治医学院：1. 生理学教研室；2. 病理生理学教研室；3. 微生物学教研室；4. 药理学教研室；5. 肝病研究所，山西长治　046000；6. 山西医科大学肝病研究所，山西太原　030001；7. 美国南加州大学Keck医学院肝病研究中心，加利福尼亚州 洛杉机　90089)



◇基础研究◇

低氧诱导因子在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达及其与糖调节蛋白78的关系

李旭炯1，张慧英2，田小霞2，陈云霞3，孟莉3，来丽娜4，赵中夫5，韩德五6，Cheng Ji7

(长治医学院：1. 生理学教研室；2. 病理生理学教研室；3. 微生物学教研室；4. 药理学教研室；5. 肝病研究所，山西长治046000；6. 山西医科大学肝病研究所，山西太原030001；7. 美国南加州大学Keck医学院肝病研究中心，加利福尼亚州 洛杉机90089)

摘要：目的探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在大鼠肝肺综合征(HPS)发病中的作用及其与糖调节蛋白78(GRP78)的关系。方法复合致病因素法制备HPS大鼠模型。Western blotting法检测肺组织HIF-1α、血管内皮生长因子164(VEGF164)及GRP78蛋白表达水平。免疫组化染色法观察肺组织VEGF受体2(VEGFR-2)及CD105的表达。结果模型组动物肺组织HIF-1α蛋白表达水平在第8周显著高于同期正常对照组及4周、6周组；GRP78蛋白表达随病程进展逐渐升高，至第8周达到最高水平，各时间点之间以及与同期正常对照组比较差异均具有统计学意义；VEGF164蛋白表达随病程进展逐渐增加，至6周达到高峰，各时间点均显著高于同期正常对照组，6周和8周表达水平显著高于4周；VEGFR-2及CD105免疫组化染色强度和数量均随HPS进展逐渐增高；GRP78分别与VEGF164、VEGFR-2及CD105的表达水平呈正相关(P<0.05)，HIF-1α与GRP78亦呈正相关关系(P<0.05)。结论HIF-1α可能在HPS发病中起一定作用，与GRP78共同促进了肺微血管重构。

关键词：肝肺综合征；低氧诱导因子-1α；糖调节蛋白78；肝硬化；血管内皮生长因子

低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)是生物体内维持氧稳态的重要转录因子[1]。低氧情况下，HIF-1α靶向调节诸如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)等多种下游靶基因的转录，在血管形成及通透性变化、炎症反应、凋亡等生理以及病理过程中起着重要的作用[2-3]。

低氧血症是肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)的重要临床特征。我们前期研究表明，在HPS发病过程中，由肝脏功能障碍形成的肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia, IETM)，一方面使巨噬细胞等炎性细胞聚集于肺组织继而活化，释放大量炎性细胞因子及血管活性因子如NO、CO、内皮素-1等，对肺组织造成严重损害，进而促进肺微血管的异常扩张[4-5]；同时引起肺组织的氧化应激和内质网应激反应，通过GRP78-VEGF途径促进肺微血管的重构[6]，从而导致低氧血症的发生。由于缺氧也是引起内质网应激的重要应激原，而活性氧和内皮素等也可以激发HIF-1α的表达[1]，故而我们推测HIF-1可能在HPS的发病过程中起一定的作用。因此，本项研究仍然在以复合致病因素诱导的大鼠HPS模型上，着重观察HPS发病过程中HIF-1α的表达变化，以及与GRP78在促进VEGF表达中的关系，为进一步揭示HPS的发病机制提供坚实基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。动物的使用及所有进行的操作均符合本单位医学伦理委员会的规定。

1.1.2主要试剂多克隆兔抗大鼠GRF78、VEGF164、VEGF受体2(VEGFR-2)抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Sigma公司；HIF-1α小鼠单克隆抗体、β-Tubulin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG及SuperECL Plus超敏发光液购自碧云天生物技术研究所；CD105抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组与模型建立雄性SD大鼠36只，随机分为正常对照组(Control)和HPS模型组各18只。正常对照组动物进食标准饲料，模型组采用复合致病因素法[7]进行制备。各组动物自由进食及饮水。分别于实验4、6、8周末各组随机选取6只动物，禁食过夜，30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉(0.1 mL/100 g体质量)，无菌、无内毒素条件下腹主动脉采血，3 000 r/min离心15 min，吸取血浆备用；摘取部分肺组织于100 mL/L中性甲醛溶液中固定，用于组织学研究。其余组织立即置于液氮中冻存。

1.2.2Western blotting法检测肺组织中GRP78、HIF-1α及VEGF164蛋白表达将肺组织样本通过液氮研磨破碎后溶解在PBS中，4 ℃离心除去沉淀取上清，加入至终浓度为1 mmol/L的苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)；测定蛋白浓度(BradfordProtein Assay Kit，上海生物工程有限公司)，将不同样本相同的蛋白量(20 μg)均调整到20 μL上样，跑60 g/L SDS-PAGE胶。LAS-4000型荧光/化学发光成像分析系统(Fiji film)显影。抗体浓度：β-Tubulin(1∶1 000)，HIF-1α(1∶500)，GRP78(1∶300)，VEGF164(1∶500)。以β-Tubulin为内参照。采用Image-Pro Plus7.0图像分析软件测定条带灰度值，计算蛋白表达水平。

1.2.3免疫组化法检测肺组织VEGFR-2和CD105的表达制备4 μm肺组织切片，常规脱蜡至水，30 mL/L H2O2室温下15 min灭活内源性过氧化物酶，并行抗原修复。PBS冲洗，50 mL/L胎牛血清(BSA)封闭20 min，分别滴加一抗(1∶500)，4 ℃过夜。依次操作顺序加入二抗及SABC，室温DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片后镜检。棕黄色颗粒为染色阳性颗粒。每张切片选取10个高倍视野(×400)，采用Image-Pro Plus7.0图像分析软件半定量分析，分别计算平均吸光度值，取平均值进行统计学分析。

2结果

2.1肺组织HIF-1α、GRP78及VEGF164蛋白表达Western blotting结果显示：在HPS发病过程中，HIF-1α蛋白水平在4周和6周未见明显变化，至第8周显著高于同期正常对照组与4周及6周组；GRP78蛋白表达随病程进展逐渐持续升高，至第8周达到最高水平，各时间点之间以及与同期正常对照组之间比较均具有统计学差异；VEGF164蛋白表达随病程进展逐渐增加，至6周达到高峰，各时间点均显著高于同期正常对照组，6周和8周时表达水平显著高于4周(图1)。

图1各组大鼠肺组织VEGF164、GRP78和HIF-1α蛋白的表达水平

Fig.1 The protein expression levels of VEGF164, GRP78 and HIF-1α in control and HPS groups

1：4周正常对照组；2：4周HPS组；3：6周正常对照组；4：6周HPS组；5：8周正常对照组；6：8周HPS组。与正常对照组比较，*P<0.05；与4周HPS组比较，△P<0.05；与6周组比较，#P<0.05。

2.2肺组织中VEGFR-2和CD105的表达免疫组织化学染色结果显示，VEGFR-2和CD105阳性表达呈浅棕黄色染色或深棕黄色，定位于微血管内皮细胞的细胞膜和(或)细胞质。在模型组染色强度和数量均随病程进展逐渐升高(图2、图3)，各组染色吸光度值检测结果见表1。模型组VEGFR-2从第4周开始显著高于对照组(P<0.05)，并且8周组显著高于4周组。模型组CD105从第6周开始显著高于对照组，并且与4周相比具有显著差异，同时8周组CD105亦显著高于6周组。

2.3相关性分析模型组动物肺组织GRP78分别与VEGF164(r=0.826，P<0.05)、VEGFR-2(r=0.885，P<0.05)及CD105(r=0.934，P<0.01)呈显著正相关；HIF-1α与GRP78亦呈显著正相关(r=0.893，P<0.05)。

表1大鼠肺组织VEGFR-2和CD105平均吸光度值的变化

Tab.1Changes of the average optic density of VEGFR-2 and CD105 in rat lung tissues

±s, n=6)

与正常对照组比较，*P<0.05；与同组4周时比较，△P<0.05。

图2各组大鼠肺组织VEGFR-2蛋白的表达

Fig.2 The expression of VEGFR-2 in rat lung tissues detected by immunohistochemistry (×400)

A：4周正常对照组；B：4周HPS组；C：6周正常对照组；D：6周HPS组；E：8周正常对照组；F：8周HPS组。

图3各组大鼠肺组织CD105蛋白的表达

Fig.3 The protein expression of CD105 in rat lung tissues detected by immunohistochemistry (×400)

A：4周正常对照组；B：4周HPS组；C：6周正常对照组；D：6周HPS组；E：8周正常对照组；F：8周HPS组。

3讨论

在不同原因引起氧稳态失衡时，HIFs发挥不同的作用。在冠状动脉疾病所致的心肌缺血、器官移植时的慢性排异、压力负荷性心力衰竭、外周动脉疾病所致肢体缺血以及伤口愈合等疾病情况下，HIFs起保护作用；而在肺动脉高压、睡眠呼吸综合征所致的高血压、视网膜新生血管化以及癌症等疾病过程中，HIFs参与了疾病的发生发展过程[1]。肺微血管重构是导致HPS发生低氧血症的重要机制，VEGF是引起血管重构的关键因子，HIF-1是促进VEGF生成的重要核转录因子。低氧情况下，HIF-1α蛋白明显增加，与HIF-1β二聚化后转位入核，继而与低氧反应基因启动子区的低氧反应元件结合，诱导VEGF等特定基因的转录[8]。本项研究结果显示，随着HPS病程进展，在实验第8周末，肺组织中HIF-1α蛋白表达明显增加，提示HIF-1参与了HPS的发病过程。

HIF-1α蛋白表达增加是促进VEGF产生的重要机制，VEGF是HIF-1α最为重要的靶基因。HIF-1α蛋白和VEGF蛋白共存于新生的血管内皮细胞中[8]；HIF-1α可以直接启动VEGF的基因转录，并且能够增强VEGF mRNA的稳定性，从而提高VEGF的表达水平[9-11]。血管内皮生长因子A(VEGFA)是VEGF家族中的重要成员，同时也是VEGF家族中促进血管生成的关键介质。VEGFR-2高度表达于参与血管生成的内皮细胞当中，可以转导促进内皮细胞增殖、存活和迁移的信号，在新血管生成的调节中起关键作用[12-13]。本项研究中，随HPS病程进展，肺组织中VEGF164(即VEGFA)、VEGFR-2蛋白表达均增加，并表现出相似的变化趋势。CD105是目前认为新生血管内皮细胞的特异性标志物，而在成熟的血管内皮细胞中弱表达或不表达，因而被认为是比CD31、CD34、FⅧ相关抗原更具特异性的新生血管标志物[[14-16]。在许多与血管重构有关的病理过程中可见HIF-1α、VEGFA、VEGFR-2及CD105的高度一致的表达[17-19]。本项研究中，也发现HPS发病过程中肺组织VEGF164、VEGFR-2与CD105的相关性表达，说明VEGF/VEGFR-2途径在HPS肺微血管重构过程中起作用；而HIF-1α蛋白表达仅在8周时与VEGF164、VEGFR-2及CD105有相似性变化，提示HIF-1α主要参与了HPS后期的发病过程，在HPS发病前期，可能存在其他激动VEGF/VEGFR-2途径的因素。

我们前期研究已经证明GRP78是与HPS发病中血管重构密切相关的蛋白质[6]。本项研究中，肺组织中GRP78蛋白表达随HPS病程进展逐渐持续增高，与VEGF164和VEGFR-2蛋白表达表现出基本一致的变化，并分别与VEGF164、VEGFR-2以及CD105呈现正相关关系，进一步说明GRP78通过VEGFA/VEGFR-2途径促进了肺微血管重构。KUO等[20]在对人类结肠腺癌HT29和DLD-1细胞使用siRNA沉默GRP78以后，可减少VEGFA及VEGFR-2表达、抑制血管形成，体外肿瘤细胞生长速率下降和体内肿瘤体积减小。该结果是HPS发病中GRP78通过VEGFA/VEGFR-2途径促进肺微血管重构的重要佐证。

HIF-1α和GRP78蛋白表达在HPS发病中呈现出不同的时相性变化，以及它们如何协调发挥作用，应当是我们关注的重要问题之一。肠源性内毒素是激活肺组织内质网应激反应导致GRP78增加的重要原因[6]；内毒素也可以直接调节单核细胞和巨噬细胞中HIF-1α的mRNA水平、促进蛋白翻译及抑制其降解来诱导表达HIF-1α[21-22]；内质网应激可以增强HIF-1α活性，内质网应激的感受分子ATF4和HIF-1均可与VEGFA的启动子结合并激活转录[23]；内质网应激可以促进HIF-1α的磷酸化，并可能由此增强HIF-1α的稳定性及转录活性[24]；沉默GRP78可使HIF-1α/VEGFA/VEGFR-2表达均减少[20]。在HPS发病过程中，GRP78持续明显升高，而HIF-1α至8周时才明显升高，很可能GRP78是主要的致血管生成因素，并且可能作为HIF-1信号通路的上游分子发挥调控作用，确切的机制及意义有待深入探讨。

综上所述，HIF-1α可能也是HPS发病中的重要因子，与GRP78共同促进了肺微血管重构。

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(编辑邱芬)

收稿日期：2015-11-12修回日期：2015-12-15

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81070339)；山西省国际科技合作计划项目(No.2010081068)；山西省回国留学人员科研资助项目(No.211-091)；山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室主任基金资助项目(No.2010-09)

通讯作者：张慧英. E-mail: zhanghy2001@163.com

中图分类号：R363.2

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604009

Pulmonary expression of HIF-1α and its relationship with GRP78 in the pathogenesis of hepatopulmonary syndrome in rats

LI Xu-jiong1, ZHANG Hui-ying2, TIAN Xiao-xia2, CHENG Yun-xia3,MENG Li3, LAI Li-na4, ZHAO Zhong-fu5, HAN De-wu6, CHENG Ji7

(1. Physiology Department, 2. Pathophysiology Department, 3. Microbiology Department,4. Pharmacology Department, 5. Liver Disease Institute, Changzhi 046000, China;6. Institute of Hepatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;7. Liver Disease Research Center, Keck Medical School of University of Southern California, Los Angeles, CA 90033, USA)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the role of HIF-1α in the pathogenesis of hepatopulmonary syndrome(HPS) and its relationship with GRP78. MethodsThe HPS model in rats was induced by multiple pathogenic factor. The samples were assessed by using Western blotting analysis for HIF-lα, GRP78 and VEGF164. The expressions of VEGFR-2 and CD105 were observed by using immunohistochemical staining. ResultsThe protein level of HIF-1α was significantly increased in HPS group at week 8 compared with that at week 4 and 6 groups and corresponding normal control groups. With the development of HPS, protein level of GRP78 was gradually increased at each time point significantly and reached the highest level at week 8; protein level of VEGF164 showed a similar change with GRP78, but the peak was at week 6. Immunohistochemical results showed that the protein expressions of VEGFR-2 and CD105 were gradually increased in lung tissue as HPS progressed. The protein level of GRP78 was positively correlated with HIF-1α, VEGF164, VEGFR-2 and CD105, respectively (P<0.05). ConclusionHIF-1α is most likely together with GRP78 to play a critical role in promoting pulmonary microvascular remodeling in the pathogenesis of HPS in rats.

KEY WORDS:hepatopulmonary syndrome; hypoxia-inducible factor-1α; 78kD glucose-regulated protein; liver cirrhosis; vascular endothelial growth factor

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81070339 ), the International Science and Technology Cooperation Project of Shanxi Province (No.2010081068), Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No.211-091), the fund from Key Laboratory of Cellular Physiology co-established by Shanxi Province and Ministry of Education in Shanxi Medical University(No.2010-09).

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.1138.022.html(2016-06-15)