血管紧张素原基因M235T突变位点与云南汉族原发性高血压的关系

李勇国 王艳飞 马娟

[摘要] 目的 探讨云南部分汉族原发性高血压（EH）患者与血管紧张素原（AGT）基因M235T突变位点的关系。方法 选择2013年1月～2014年1月年在昆明市第一人民医院心内科住院的行动态血压及相关临床检查确诊为EH的患者122例为EH组，同期入选44例行动态血压排除高血压的患者为对照组。收集EH组和对照组基本临床资料，包括年龄、性别比例、血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、平均左室舒张末径、平均左室收缩末径、左室射血分数等指标，所有患者遵守知情同意的原则，采集被检者静脉血0.5 ml，通过聚合酶链反应技术及基因芯片技術检测AGT基因M235T，同时对样本进行序列测定，比较各组间基因型分布和等位基因的频率分布。 结果 EH组AGT M235T基因型分布与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.122），EH组AGT-TT、AGT-MT和AGT-MM基因型频率分别为43.4%、54.9%、1.6%，对照组分别为31.8%、61.4%、6.8%；T等位基因频率EH组（70.9%）与对照组（62.5%）比较，差异无统计学意义（P=0.145）。 结论 AGT基因M235T基因变异与云南汉族人群EH的发病可能无相关性，AGT基因多态性可能不是EH的危险因素。

[关键词] 原发性高血压；血管紧张素原；基因

[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）03（a）-0041-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between essential hypertention（EH） in part of the han nationality in Yunnan and gene M235T mutations of angiotensinogen（AGT）. Methods 122 patients，conducted ambulatory blood pressure and related clinical examination and diagnosed as EH in the First People′s Hospital of Kunming Heart Medicine from January 2013 to January 2014 were selected as EH group.44 patients，conducted ambulatory blood pressure and excluded hypertension at the same term，were selected as control group.Basic clinical data included age，sex ratio，serum total cholesterol，high-density lipoprotein，low-density lipoprotein，triglyceride，average left ventricular end-diastolic diameter and average diameter at the end of the left ventricular contraction left ventricular ejection fraction were collected.All patients were abided by principles of informed consent.0.5 ml venous blood of patients were collected and the gene M235T of AGT were tested by using PCR and gene chip technology.The sample were conducted sequence determination to compare the genotype and allele frequency distribution in different groups. Results The difference of AGT M235T genotype distribution between EH group and control group had no statistical significance （P=0.122）.The genotype frequency of AGT-TT，AGT-MT and AGT-MM in EH group was respectively 43.4%，54.9% and 1.6%，which was respectively 31.8%，61.4% and 6.8% in control group.The T allele frequency had no obvious difference between EH group（70.9%） and control group（62.5%）（P=0.145）. Conclusion It has no relationship between gene M235T mutations of angiotensinogen and essential hypertention in Han nationality of Yunnan crowd.The gene polymorphism of AGT may not be risk factors of essential hypertention.

[Key words] Essential hypertention；Angiotensinogen；Gene

原发性高血压（essential hypertension，EH）是目前发病率最高的一种心血管疾病。现对EH的发病机制仍未研究透彻。但大量研究证实，EH属“复杂疾病”，遗传因素、心理社会因素、体表指数、年龄、膳食等对其发病均有影响，其中20%～40%的血压变化与遗传因素有关，因此筛选高血压候选基因已成为高血压研究的重点之一[1]。众多的EH候选基因及候选位点当中，易感基因最有可能为编码肾素-血管紧张素的基因，其中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的前体物质是血管紧张素原（angiotensinogen，AGT），AGT的浓度变化限制了RAS中AngⅡ的转化速度。目前有关AGT基因多态性与EH之间的关系得出的结论各有不同。一方面考虑为研究人群种族遗传及地理环境的差异，其次还与检测方法及检测技术各不同存在很大关系。尽管通过研究不同人群、种族、利用不同的研究技术方法对AGT基因M235T多态性与EH的关系进行研究，同时研究的相关报道也较多，但对云南部分汉族高血压人群的相关研究较少。本研究旨在探讨血管紧张素原基因M235T突变位点与云南汉族人群EH的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月～2014年1月在昆明市第一人民医院心内科的住院患者，受试者均为该地区的汉族人群。受试者均对调查和检测项目知情同意。行动态血压检查诊断为EH患者122例，男79例，女43例，平均年龄（61.88±12.68）岁。选择同期行动态血压检查证实未患有高血压的患者44例为对照组，男27例，女17例，平均年龄（63.59±9.87）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。所有病例均符合WHO的高血压诊断标准。EH诊断标准依据《1999WHO/ISH高血压处理指南》的建议：在未服用抗高血压药的情况下，收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg，排除继发性高血压。同时经病史、体检、实验室检查和心脏超声、心电图、血压等检查排除冠心病、高血压、心肌病、瓣膜性心脏病和先天性心脏病者。

1.2 研究方法

1.2.1 各生化、心脏超声指标的测定 所有患者清晨空腹抽取无抗凝剂静脉血2 ml送检。血标本严格按操作要求处理，均在2 h内完成检测。采用美国Beckman Coulter DxC80 全自动分析仪测定血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油等指标。应用美国GE公司生产的彩色多普勒超声仪Vivid 7，探头频率2～4 MHz，通过Simpon方法测量出平均左室舒张末径、平均左室收缩末径、左室射血分数等指标。

1.2.2 标本的采集 遵守知情同意的原则，采集被检者静脉血0.5 ml，用一次性无菌注射针头抽取，放入含50 μl的2%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，置于1.5 ml的无菌离心管中，盖上盖子，上下颠倒混匀，通过低渗法裂解红细胞，分离白细胞，饱和酚/氯仿法抽提基因组DNA。利用TE缓冲液溶解，标本在4℃保存。保存≤3周。

1.2.3 PCR 扩增 采用适用0.2 ml扩增管并有热盖的PCR扩增仪扩增。

1.2.4 杂交显色 将反应试管条通过BaiO FLWS-526全自动杂交仪进行杂交。结束后将取出的芯片放入BaiO BE-2.0生物芯片识读仪，图像Array Doctor软件分析可自动输出检测结果，最后检测出AGT M235T基因的多态性位点。

1.3 统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组一般临床资料的比较

EH组的年龄、性别比例、血清总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、平均左室舒张末径、平均左室收缩末径、左室射血分数等指标与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2 两组AGT基因M235T多态性检测

EH组及对照组的基因型频率适合度检测显示皆达到Hardy-Weinberg平衡。基因型在EH组及对照组均以MT型最多见，TT型次之；EH组AGT-TT基因型频率高于对照组，但两组间AGT M235T基因型分布差异无统计学意义（χ2=4.1998，P=0.122）。EH组T等位基因型频率高于对照组，两组M等位基因频率分别为29.1%（EH组）、37.5%（对照组），T等位基因频率分别为70.9%（EH组）、62.5%（对照组），两组比较差异无统计学意义（χ2=2.122，P=0.145）（表2）。

3 讨论

高血压是人类常见的一种心血管疾病，可分为原发性和继发性两大类。多数患者高血压的病因机制不明，称为EH，所占比例达95%以上。目前认为肾素-血管紧张素系统（RAS）在高血压的发生、发展中起到重要作用[2]。当编码AGT的外显子2区域核苷酸704处胸腺嘧啶（T）被胞嘧啶（C）替代，导致基因编码产物第235号氨基酸由蛋氨酸（M）变异为苏氨酸（T），即M235T分子变异，会出现3种基因型，MM、MT和TT。AGT作为RAS的关键分子，其第2外显子M235T位点的多态性与EH相关性的报道近来较多，但结论不一致[3-5]。AGT基因M235T基因变异致高血压的机制尚未完全确切。Jeunemaitre等[6]对AGT基因M235T基因变异与高血压的相关研究证实，携带T235等位基因者血浆AGT浓度超出不携带T235等位基因者的10%～20%，而血浆AGT是AngⅡ合成的前提物质，血浆AGT浓度升高导致的结果是AngⅠ、AngⅡ生成增加，最终强烈的收缩血管反应导致血压升高[7]。本实验关于AGT基因M235T突变位点与云南EH关系的研究结果显示，部分汉族EH人群和正常人群的AGT M235T基因型分布差异无统计学意义；两组T等位基因频率分别为70.9%（EH组）、62.5%（对照组），差异无统计学意义，提示AGT基因M235T基因变异与云南汉族人群EH的发病可能无相关性。

1992年Jeunemaitre等[6]在高血压同胞配对研究中首次发现AGT基因M235T变异与高血压的相关性，高血压患者235T等位基因的频率明显高于对照组。龙莉等[8]研究了关于AGT基因M235T多态性在云南彝族人群中的分布，得出AGT基因M235T多态性分布存在民族、种族差异。王瑞丽等[9]研究促血管收缩相关基因多态性与哈萨克族EH相关性，得出哈萨克族人EH主要与AGT基因M235T多态性、AGT基因核心启动子（AGCEI）G-6A变异、醛固酮合成酶基因多态性有关。也有学者认为，M235T不会引起AGT蛋白在结构和功能方面发生变化，提示M235T只是作为一个标记点，不是功能性的，AGT基因之中或其邻近部位一个未知功能位点上的基因发生了变异及这个未知功能位点和M235T之间产生不平衡均可能是导致高血压发病的机制[9]。因此，在研究不同人种AGT基因突变与EH的关系得出的结论也各不相同[10]。一方面原因考虑为研究人群种族遗传及地理环境的差异，本文汉族人相关等位基因还存在异质性，可能与EH受多个影响因素有关，仅从人群自身研究不全面，还需结合生活习惯等因素进行研究[11-12]，其次还与检测方法及检测技术各不同存在很大关系，目前检测AGT基因M235T多态性的方法有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）、等位基因特异性寡核苷酸杂交法（PCR-ASO）、突变基因分离聚合酶链多态性反应法（MS-PCR）、改良PCR-RFLP法（以SfaN-Ⅰ消化）、PCR聯合变性梯度胶电泳法（DGGE）。其中传统的PCR-RFLP应用最为广泛。也有关于监测方法不同对结果的影响研究，提示应用多年的PCR-RFLP仍不失为一种确切可行的检测AGT基因M235T多态性的方法，而新型MS-PCR的应用还需行进一步的研究，所以不同监测手段仍是影响因素[13-14]。继续对AGT基因M235T多态性的进一步分析，有利于心血管疾病的诊治及预防。

综上所述，EH是由遗传及环境共同作用的结果，而AGT基因是高血压遗传易感性的主要候选基因之一[15]。不同地区、不同种族可能造成其对某些疾病的易感性存在明显差异，同时其他一些因素的影响也可能导致易感性存在差异。因此进行相关研究可以对高血压高危人群的预测及临床指导有重要的理论意义。本研究对AGT基因M235T突变位点与云南汉族EH的关系进行初步探讨，为进一步基因多态位点研究积累了资料。

[参考文献]

[1] Gu D，Reynolds K，Wu X，et al.Prevalence，awareness，treatment，and control of hypertension in China[J].Hypertension，2002，40（8）：920-927.

[2] Dickson ME，Sigmund CD.Genetic basis of hypertension：revisiting angiotensinogen[J].Hypertension，2006，48（1）：14-20.

[3] Hingorani AD，Sharma P，Jia H，et al.Blood pressure and the M235T polymorphism of the angiotensinogen gene[J].Hypertension，1996，28（5）：907-911.

[4] Fernández-Llama P，Poch E，Oriola J，et al.Angiotensinogen gene M235T and T174M polymorphisms in essential hypertension：relation with target organ damage[J].Am J Hypertens，1998，11（4 Pt 1）：439-444.

[5] Ragg H，Preibisch G.Structure and expression of the gene coding for the human serpin hLS2.[J].J Biol Chem，1988， 263（24）：12129-12134.

[6] Jeunemaitre X，Soubrier F，Kotelevtsev YV，et al.Molecular basis of human hypertension：role of angiotensinogen[J].Cell，1992，71（1）：169-180.

[7] 張春雨，赵世刚，牛广明，等.蒙古族人群原发性高血压与AGT M235T及CYP11B2 C-344T基因多态性的相关性研究[J].中国医师杂志，2007，9（1）：31-33.

[8] 龙莉，杨榆玲，瞿秋，等.血管紧张素原基因M235T多态性在云南彝族人群中的分布[J].昆明医科大学学报，2012，33（11）：4-7.

[9] 王瑞丽，王冬晓，古丽丽，等.促血管收缩相关基因多态性与哈萨克族原发性高血压相关性研究[J].中国民族民间医药，2012，12（8）：25-26.

[10] 杨月明，何姬苓.血管紧张素原基因多态性与我国高血压和脑卒中的关系[J].中国全科医学，2008，11（2）：262.

[11] Li X，Du Y，Huang X.Correlation of angiotensin-converting enzyme gene polymorphism with effect of antihypertensive therapy by angiotensin converting enzyme inhibitor[J].Cardiovasc Pharmacol Ther，2003，8（1）：25-30.

[12] 朱旭明，谢国强，张健，等.血管紧张素原基因M235T多态性与原发性高血压相关性的Meta分析[J].重庆医学，2013，42（11）：3759-3760.

[13] Kawada N，Moriyama T，Imai E，et al.Angiotensinogen gene polymorphism of threonine/methionine at position 235-potential problems of the modified restriction endonuclease（Tth111-Ⅰ） digestion method[J].J Nephrol，1997， 10（6）：314-317.

[14] Rust S，Funke H，Assmann G.Mutagenically separated PCR（MS-PCR）：a highly specific one step procedure for easy mutation detection[J].Nucl Acids Res，1993，21（16）：3623-3629.

[15] Fornage M，Turner ST，Sing CF，et al.Variation at the M235T locus of the angiotensinogen gene and essential hypertension：a population-based case-control study from Rochester，Minnesota[J].Hum Genet，1995，96（3）：295-300.

（收稿日期：2015-11-20 本文编辑：王红双）