EGCG通过减少线粒体DNA水平减轻百草枯导致急性肺损伤的实验研究*

何谦　熊骥　曹钰　庞路人

(四川大学华西医院急诊科， 四川 成都 610041)

·论著·

EGCG通过减少线粒体DNA水平减轻百草枯导致急性肺损伤的实验研究*

何谦熊骥曹钰庞路人

(四川大学华西医院急诊科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的研究没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对百草枯导致急性肺损伤保护作用的机制。方法选用60只清洁级Ⅱ级健康SD雄性大鼠分别建立对照组、百草枯组(PQ组)和PQ+EGCG干预组(PQ+EGCG组)，每组各20只。24小时后分别取各组大鼠的肺泡灌洗液、肺组织进行肺组织干湿重比、肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6测定以及肺组织HE染色。结果百草枯组肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6明显升高，而经过EGCG预处理后，3项指标均明显下降(均P<0.05)。肺组织干湿重比和病理评分在百草枯组明显升高，说明肺组织出现明显炎性浸润；而在PQ+EGCG组中均明显降低(均P<0.05)。结论本研究结果发现，EGCG可以通过保护线粒体、减少mtDNA释放，降低百草枯导致的肺组织炎症反应水平，同时为百草枯导致急性肺损伤的机制研究和治疗提出了一个新的理论基础。

【关键词】没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；急性肺损伤；线粒体DNA；炎症反应

百草枯是一种广泛应用的有机杂环类除草剂，具有效果好、价格低的特点。目前市面上流通的主要是浓度20%的百草枯，由于其极高的毒性，许多人由于误服百草枯或服用百草枯自杀，病死率可达到50%～90%，并且伴有极其严重的肺、肾、胰脏并发症[1-3]。目前对百草枯中毒的机制尚不明确，也没有特效解毒药物。有关百草枯引起的急性肺损伤机制也尚不清楚。但很多研究显示，严重的局部炎症反应在百草枯引起的急性肺损伤中发挥了重要作用[4]。

线粒体DNA(mtDNA)是一种特殊的损伤相关分子模式(damage associatedmolecularpatterns，DAMP[5,6]。最近有大量文献报道，在各种组织损伤过程中有mtDNA的释放，并且循环mtDNA的含量与组织损伤程度呈正相关[7,8]。同时mtDNA作为古细菌在真核生物中的内共生产物，具有未甲基化的CpG片段，可以引起机体的炎症反应[9]。没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶的提取物，具有抗氧化、抗炎活性[10, 11]。本研究旨在揭示mtDNA在百草枯导致急性肺损伤中的作用，以及研究EGCG是否可以通过减少mtDNA而保护百草枯急性中毒导致的急性肺损伤。

1材料及方法

1.1动物分组及模型建立将清洁级Ⅱ级健康雄性SD大鼠60只(体重250～300g，购自四川大学华西实验动物中心)，分别建立对照组、百草枯组(PQ组)和PQ+EGCG干预组(CPQ+EGCG组)各20只。百草枯组大鼠经腹腔注射20%PQ液30mg/kg(英国捷利康有限公司)，建立PQ急性中毒模型；为了保证EGCG达到最低血药浓度，EGCG+PQ组大鼠在腹腔注射PQ前2小时通过腹腔注射EGCG 4.0mg/kg进行预处理；对照组注射等量无菌生理盐水。

1.2肺泡灌洗液(BALF)获取和肺组织病理学检查建立动物模型24小时后，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉实验动物，开胸，暴露气管及肺，用套管针插入左支气管并固定，拔出针芯后用2ml生理盐水灌洗左肺，然后缓慢回抽，如此反复3次，收集3次的灌洗液，回收率约75%。同时取出右上肺，于福尔马林中固定24小时后常规石蜡包埋、切片，行HE染色，观察肺组织病理改变情况。

1.3实时荧光定量PCR技术测定肺泡灌洗液中mtDNA浓度使用DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)提取BALF中全部DNA。严格按照试剂盒说明书进行操作，最终将DNA溶解于200μl DNA溶解液中[11]。BALF中mtDNA测定基于SYBR-Green染色的荧光定量PCR技术，步骤为：初始阶段50 ℃，2 分钟；第一步变性温度为95 ℃，3 分钟；进行95℃ 10秒、55 ℃ 15秒和72 ℃ 10秒，共39个循环。标准曲线为携带有人类mtDNA的质粒(美国ORIGENE公司) 10 倍梯度稀释获得。mtDNA浓度使用标准的转换系统转换成拷贝数(copies)。BALFmtDNA浓度的计算公式为：c=Q*VDNA/VPCR*1/VEXT。其中c 为BALF中mtDNA 的浓度，Q 为荧光定量PCR 检测的样本中mtDNA 的拷贝数，VDNA为每个BALF样本中提取DNA 的总体积，本研究中为200μl；VPCR代表荧光定量PCR 时加入DNA 的体积，本研究中为1 μl；VEXT代表提取DNA 时使用的BALF的量，本实验中为50 μl。

1.4TNF-α、IL-6测定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6分别采用相应的试剂盒(索莱宝，北京)进行测定，所有步骤均严格按照说明书进行。

1.5肺干湿重比(DWR)检测开胸取右下肺组织，称重后置80℃烤箱烘烤48小时，干燥至恒重。肺干湿比=湿重/干重。

1.6肺组织损伤评分标准在处死动物后取得的肺病理切片中，对镜下肺组织的以下5种病理改变进行综合评估：肺泡腔壁水肿增厚、肺泡内出血、中性粒细胞浸润肺泡腔或浸润肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根据每项有无指标病变，进行评分(0=无病变，1=有病变)，累加各项评分的总分作为肺病理损伤评分， 0分为正常肺组织，5分为损伤最严重的肺组织。

2结果

2.1各组大鼠BALF中mtDNA及炎症因子水平PQ组BALF中mtDNA显著高于对照组(P<0.05)，PQ+EGCG组BALF中mtDNA水平较PQ组显著降低(均P<0.05)。PQ组BALF中TNF-α、IL-6显著高于对照组(均P<0.05)，PQ+EGCG组BALF中mtDNA水平较PQ组显著降低(P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠BALF中mtDNA及炎症因子水平比较

注：与对照组比较，①P<0.05;与PQ组比较，②P<0.05

2.2各组大鼠肺干湿重比情况PQ组肺干湿重比显著高于对照组(P<0.05)，PQ+EGCG组肺干湿重比较PQ组显著降低(P<0.05)，见表2。

2.3各组大鼠肺组织病理改变情况PQ组较对照组肺组织出现肺泡壁组织水肿、肺间质出血以及中性粒细胞浸润等典型肺损伤的病理结构改变，PQ+EGCG组出现肺组织病理损伤程度较PQ组显著改善；PQ组肺病理评分显著高于对照组(P<0.05)，PQ+EGCG组肺病理评分较PQ组显著降低(P<0.05)，见图1。

表2　各组大鼠肺干湿重比较±s)

注：与对照组比较，①P<0.05；与PQ组比较，②P<0.05

图1各组肺病理改变情况

Figure 1Pathological changes of lung tissue

注：PQ组(B)肺损伤程度明显较对照组(A)严重，EGCG+PQ组(C)肺病理损伤程度较PQ组(B)减轻

2.4各组大鼠肺组织损伤程度按损伤肺组织病理评分评定肺损伤程度，结果见表3。

表3　各组大鼠肺损伤程度比较±s)

注：与对照组比较，①P<0.05；与PQ组比较，P<0.05

3讨论

在本研究中我们发现，百草枯引起大鼠急性肺损伤主要以弥漫性肺泡损伤为特征性表现，肺组织HE染色可见肺泡壁增厚、破损，同时大量炎性细胞浸润，肺组织干湿重比明显升高。进一步肺泡灌洗液检查发现，炎症因子TNF-α、IL-6和mtDNA的表达明显增加。本研究还首次发现，在百草枯导致大鼠急性肺损伤之肺泡灌洗液中mtDNA含量明显升高。在预先给予EGCG处理后，大鼠急性肺损伤程度明显减轻，肺泡灌洗液中mtDNA和炎症因子水平明显下降。

EGCG是绿茶中的主要活性成分，具有强大的抗氧化、消除活性氧集团和抗炎性作用，大量研究显示，其抗炎性作用主要是通过抑制细胞内NF-κB介导的炎性信号通路[12-15]。本研究结果显示，在EGCG预处理情况下，肺泡灌洗液中的3种炎症因子表达水平出现明显下降，同时肺组织HE染色显示肺组织水肿程度降低，炎性细胞浸润减少，肺组织干湿重比水平下降。说明EGCG确实可以降低百草枯导致的急性肺组织炎性反应，改善急性肺损伤程度。但是对于EGCG保护作用的机制仍不清楚，需要进一步研究。

目前有文献报道EGCG的抗氧化作用[16]，线粒体作为细胞内能量供应的细胞器，其功能损伤和异常极易导致电子传递链的中断，引起活性氧集团的大量产生而进一步损伤细胞。mtDNA的释放被认为是发生在线粒体氧化应激损伤之后，表现为线粒体的严重水肿，部分mtDNA发生水解，通过线粒体膜上的通透性孔道释放[17]。本研究百草枯所致急性肺损伤中肺泡灌洗液的mtDNA水平明显升高，说明肺泡上皮细胞出现严重的线粒体损伤，mtDNA从线粒体中逐渐被释放到肺间质中。而EGCG预处理后，mtDNA水平明显下降，表明EGCG可能作用于线粒体，减轻线粒体的氧化应激损伤并稳定线粒体膜，减少mtDNA释放到细胞外。

目前有大量研究表明，循环mtDNA可以激发炎症介质的大量释放并导致全身炎症反应，它可在体外引起神经元细胞和胶质细胞炎症因子的释放[18, 19]，刺激人外周血单核细胞系THP-1释放大量IL-6和TNF-α[20]。此外，mtDNA的释放也可以刺激体内白细胞的活化，触发一系列炎症级联反应[21]。结合我们的研究结果，我们认为释放到细胞外的mtDNA在百草枯导致的急性肺损伤中发挥了重要作用。在EGCG预处理后，肺泡灌洗液中mtDNA水平和炎性因子表达水平均明显下降，说明在减少mtDNA的释放后，炎症反应水平也相应下降，EGCG同时具有抗炎和抗氧化的作用。因此，我们有理由相信，EGCG可以部分通过稳定线粒体，减少mtDNA的释放来发挥其抗炎作用。

4结论

我们的研究发现，EGCG可以通过保护线粒体，减少mtDNA的释放，从而降低肺组织炎症反应水平。结合肺组织病理切片和肺组织干湿重比分析，我们认为，EGCG对于百草枯导致的急性肺损伤可以发挥有效地保护作用。因此，我们的研究为EGCG抗氧化、抗炎作用的机制提供了新的思路，也为百草枯导致急性肺损伤的机制研究和治疗提出了一个新的理论基础。

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Epigallocatechin-3-gallate protects paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mitochondrial

DNAHE Qian,XIONG Ji，CAO Yu,et al

(DepartmentofEmergency，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of the protective effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on paraquat-induced acute lung injury. Methods60 SD rats were divided into the control group, paraquat(PQ) group and PQ+EGCG group. After 24 h, broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected to measure levels of mtDNA, TNF-α and IL-6, and wet/dry ratio and HE staining, respectively. ResultsOur data showed that levels of mtDNA, TNF-α and IL-6 elevated in PQ group, which could be inhibited by EGCG(P<0.05). Wet/dry ratio and pathological score of PQ group were higher than that of the control group, which could be also inhibited by EGCG(P<0.05). ConclusionWe find that EGCG can protect paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mtDNA. Meanwhile, we also provide a novel theory for understanding and treating paraquat-induced acute lung injury.

【Key words】Epigallocatechin-3-gallate; Acute lung injury; Mitochondrial DNA; Inflammatory responses

基金项目:国家自然科学基金(0040205401B83)

通讯作者：曹钰，教授，本刊常务编委，E-mail：yuyuer@126.com

【中图分类号】R-33

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.005

(收稿日期：2016-03-29； 编辑： 母存培)