三七总皂甙对颅脑损伤大鼠血浆及海马中ET-1 CGRP的影响*

许刚　巩守平　崔刚　僧志远　高李贵　屈建强

(西安交通大学第二附属医院神经外科， 陕西 西安 710004)

·论著·

三七总皂甙对颅脑损伤大鼠血浆及海马中ET-1 CGRP的影响*

许刚巩守平崔刚僧志远高李贵屈建强

(西安交通大学第二附属医院神经外科， 陕西 西安 710004)

【摘要】目的探讨大鼠颅脑损伤后血浆、海马内皮素(ET-1)及降钙素基因相关肽(CGRP)水平的变化，以 及三七总皂甙(PNS)对其影响。方法80只Wister大鼠随机分为空白组、模型组、PNS低剂量组、PNS高剂量组各20只，采用Feeney法建立大鼠颅脑损伤模型，RIA法测定颅脑损伤72小时大鼠血浆及海马中ET-1、CGRP的含量,HE和Niss染色观察大鼠大脑及海马病理变化。结果与空白组比较，模型组大鼠血浆及海马中ET-1显著升高(P<0.05)，CGRP明显下降(P<0.05)；与模型组比较，PNS低、高剂量均能显著降低血浆及海马中ET-1水平(均P<0.05)，升高CGRP含量(均P<0.05)；高剂量组与低剂量组ET-1及CGRP水平比较均有显著性差异(均P<0.05),提示PNS能减轻脑损伤大鼠脑组织的细胞形态学变化，减少海马神经元的死亡数量。结论三七总皂甙可显著降低颅脑损伤大鼠血浆及海马中ET-1含量，升高CGRP水平，减轻颅脑损伤后继发性脑损害。

【关键词】颅脑损伤；内皮素；降钙素基因相关肽；三七总皂甙

颅脑损伤不仅包括颅脑损伤瞬间造成的机械性原发性损伤，也包括缺血、缺氧等继发损害，其中继发性损害是其预后不良的重要影响因素[1]。因此如何减轻继发性缺血、缺氧性损害，是提高颅脑损伤救治水平需要解决的关键问题之一。内皮素(Endothelin,ET-1)是一种具有强力生物活性的血管收缩因子，在脑缺血的病理生理反应过程中发挥重要作用。降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)广泛分布于中枢、外周神经系统以及心血管系统，是目前已知的最强的血管扩张剂，与ET-1之间具有强烈的相互拮抗作用[2]。研究发现，颅脑损伤后血浆及脑脊液中ET-1水平显著升高而CGRP水平显著下降[3,4]。三七总皂甙(Panax notoginseng saponins, PNS)为三七干燥根茎提取成份，含人参皂甙Rb1、人参皂甙Rg1和三七皂甙R1，近年研究表明，它能够降低颅脑损伤后自由基的产生，减轻脑水肿和脑组织病理性损害[5],然而其对颅脑损伤后血浆及海马中ET-1、CGRP和海马中神经元变化的影响却未见报道。本研究采用改良Feeney[6]法建立大鼠颅脑损伤模型，观察颅脑损伤后血浆及海马中ET-1、CGRP水平，以及海马中神经元变化和三七总皂甙对其的影响，探讨其对颅脑损伤的作用及相关可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康清洁级Wister大鼠80只，雌雄不拘，体重(280±50)g,由西安交通大学实验动物中心提供(陕医动字110033)。购后自然光照，随意进食，饲料为该中心提供的标准全价饲料，饮用水为自来水，观察1周正常后进行实验。按照实验设计随机分为空白对照组(n=20)、模型组(n=20)和PNS低剂量组(n=20)、PNS高剂量组(n=20)。

1.2主要试剂及仪器三七总皂甙注射液(云南植物药业有限公司，批号：0040509011，250 mg/10ml)；内皮素放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所提供，编号：040602)；降钙素基因相关肽放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所提供，编号：040671)；SN-695B型智能放免测量仪(上海原子核物理研究所研制)。冰冻切片机(CM1900型，德国Leica公司)。

1.3实验动物的造模空白组不造模，其余各组均采用Feeney[6]自由落体脑损伤的方法造成颅脑损伤模型。大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥钠50mg/kg麻醉后，俯卧位固定于底板上，固定头部，剪去顶毛并消毒，沿正中矢状线切开头皮，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后1.5mm、中线旁开2.5mm处钻一直径5mm的骨窗，保持硬脑膜完整，将直径4.5mm的圆锥型撞击端置于骨窗硬膜外，用20g砝码由30cm高度自由下落撞击撞击端，造成右顶叶脑挫裂伤,充分止血后，骨蜡封闭骨窗，碘伏消毒伤口后缝合头皮。

1.4给药剂量及方法给药剂量：依据D大鼠=D人×R大鼠÷R人公式[7]计算大鼠PNS注射液用药量，低剂量组药量的2倍定义为高剂量。于大鼠造模完成后5min及24、48、70h，空白组及模型组腹腔注射与PNS低剂量组同剂量的生理盐水；低剂量组腹腔注射PNS 100mg/kg;高剂量组腹腔注射PNS 200mg/kg。

1.5实验标本的制备与检测

1.5.1血浆标本制备各组大鼠饲养72小时后，各组取12只，断头处死采血4ml, 注入含7.5%EDTA60μl和抑肽酶80μl的试管中，混匀，4℃3000rpm离心10min,分离血浆，分装2份，-20℃保存。

1.5.2海马标本制备将1.5.1中断头处死大鼠的头颅放入液氮中冷冻5min，分出右侧海马，称重，按1∶5(W/V)加入0.1mol醋酸略做研磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，再次研磨制成匀浆，4℃ 3000rpm离心15min，取上清液分装2份-20℃保存。

1.5.3ET-1、CGRP检测用放免法测定脑创伤大鼠血浆及海马中ET-1、CGRP含量(按照说明书标准步骤进行操作)。

1.5.4病理检查取各组大鼠8只，断头处死，右脑置入100g/L福尔马林液中固定72小时，递增乙醇脱水，常规石腊包埋，病灶组织石蜡块连续冠状切片，片厚 51μm，隔 10 张取3张，共取12张，标记编号，晾干烤片, 行HE及尼氏体染色，对海马CA-1区进行检查。尼氏体染色采用1%甲苯胺蓝方法：①切开脱蜡至水。②1%甲苯胺蓝染10分钟，37℃。③蒸馏水洗。④95%酒精分化至尼氏小体仅成蓝色。⑤纯酒精脱水、透明、封固。结果：尼氏小体紫色，胶质细胞淡紫色，背景无色。

2结果

2.1各组血浆及海马中ET-1及CGRP水平比较于造模后72小时，与空白组比较，模型组血浆及海马ET-1水平显著升高(P<0.05)；CGRP水平显著下降(P<0.05)；与模型组比较，PNS低、高剂量组血浆及海马ET-1水平均显著下降(均P<0.05)，CGRP水平均显著升高(均P<0.05)；PNS低、高剂量组间ET-1及CGRP水平差异也有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2右侧大脑HE染色结果空白组未见异常；模型组神经细胞变性，溶解坏死，脑细胞疏松水肿，间质水肿及大片出血改变伴中性粒细胞浸润，并有围血管现象；PNS低剂量组神经细胞坏死减少，可见神经细胞变性，间质血管扩张、充血伴部分疏松水肿，见灶性出血；PNS高剂量组所有标本神经细胞坏死不明显，神经细胞变性减轻，间质血管扩张、充血，见图1～4。

表1　各组大鼠血浆及海马中ET-1、CGRP水平比较

注：与空白组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与PNS低剂量组比较，③P<0.05

图1空白组(HE×20)

Fig 1Blank group (HE×20)

图2模型组(HE×20)

Fig 2Model group (HE×20)

图3PNS低剂量组(HE×20)

Fig 3PNS low dose group (HE×20)

图4PNS高剂量组(HE×20)

Fig 4PNS high dose group (HE×20)

2.3右侧海马尼氏染色CA1区神经元计数各组大鼠海马CA1区平均数目如下：空白组180个/HP，模型组80个/HP，PNS低剂量组120个/HP，PNS高剂量组140个/HP，见图5～8。

图5空白组(Niss×20)

Fig 5Blank group (Niss×20)

图6模型组(Niss×20)

Fig 6Model group (Niss×20)

图7PNS低剂量组(Niss×20)

Fig 7PNS low dose group (Niss×20)

图8PNS高剂量组(Niss×40)

Fig 8PNS high dose group (Niss×40)

3讨论

脑血管痉挛在中重型颅脑损伤患者中的发生率约为5%～41%[8]。颅脑损伤后脑血管痉挛可使脑血流下降，脑组织灌注不足，造成脑组织缺血缺氧，从而加重脑损害。重型颅脑损伤患者脑血流量降低，伤后72小时脑氧摄取率明显下降[9，10]。ET作为一种具有强烈收缩血管作用的神经递质，在中枢神经系统中平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经和胶质细胞均可分泌。CGRP是一种具有强烈舒血管作用的神经肽，广泛存在于支配脑血管的神经末梢。研究发现[11]，脑损伤后脑血管痉挛与血浆ET-1浓度变化呈正相关,与CGRP呈负相关。苑玉清等[12]发现，急性重型颅脑损伤患者血浆中ET与CGRP含量差值及平均动脉压与对照间有显著性差异,且二者间呈正相关。表明ET的缩血管活性明显超过CGRP的舒血管活性，从而对急性重型颅脑损伤患者伤后平均动脉压的升高起主要作用,差值越大平均动脉压越高。平均动脉压的升高在一定范围内提高脑动脉灌注压,以对抗因血管痉挛所致的供血不足,进一步保护脑功能。但当血压持续增高并突破其调节上限时,则会发生脑过度灌注,此时MABP越高,过度灌注越严重。脑血流的过度灌注可进一步加重脑水肿和血脑屏障的损害,使病情急剧发展,最终导致脑疝,危及生命。急性重型颅脑损伤中ET、CGRP与平均动脉压三者间的病理生理反应过程在某种程度上与急性颅高压危象时的Cushing反应相吻合。急性重型颅脑损伤患者伤后ET过度的产生和释放以及CGRP的非同步性增高,是造成急性重型颅脑损伤患者病情恶化的极为重要的病理生理反应因素。同时ET/CGRP比值的变化是影响脑损伤患者病情及预后的一个客观指标[13]。本实验结果表明,大鼠颅脑损伤后血浆、海马中内皮素含量增高,降钙素基因相关肽水平下降，海马神经元坏死数增加。

目前颅脑损伤后ET-1及CGRP变化的机制不甚清楚,可能与下列因素有关[14]:①颅脑损伤后全身应激反应,肾上腺素生成增加,刺激ETmRNA的表达,导致内皮细胞大量分泌ET-1。②颅脑损伤时,血管内皮直接受损造成ET-1外溢。③颅脑损伤时颅内出血尤其是SAH,红细胞破裂释放氧合血红蛋白,刺激内皮细胞增加ET-1的分泌。④颅脑损伤时颅内压升高,脑血流量下降,脑缺血缺氧刺激ETmRNA的表达。⑤颅脑损伤时大量神经元受损,因颅内压升高,灌注压降低致脑缺血,大量神经元变性坏死,以致CGRP合成与释放减少,消耗增多。

本实验研究发现，PNS低、高剂量治疗后大鼠血浆及海马中内皮素下降及降钙素基因相关肽上升，海马神经元死亡数量减少；且PNS高剂量明显优于PNS低剂量组，表明PNS在颅脑损伤中有十分明显的脑保护作用，且呈一定的量效关系。PNS能够改善微循环，增加脑血流量，降低机体耗氧，提高机体对缺氧的耐受能力，不仅广泛应用于缺血性脑血管疾病，而且对重型颅脑损伤患者也具有明显的治疗效果。推测其机制可能与以下作用有关：①PNS阻断受体依赖钙通道开放，抑制脑血管平滑肌钙内流，降低颅脑损伤后的细胞内钙超载，抑制线粒体跨膜电位下降，保护线粒体功能[15]。②PNS阻断了颅脑损伤后ET-1与CGRP比例失衡，通过调节脑血管的舒缩状态及纠正脑血流量的自身调节失衡，改善微循环及血脑屏障通透性，增加大脑局部血流量，减轻血管源性脑水肿，降低脑代谢率，减少兴奋性氨基酸的产生，清除自由基，减轻神经细胞损害，增强损伤脑组织的修复[16]。③PNS可保护血管内皮细胞结构及功能的完整性，这也可能是其降低ET-1水平的因素之一。

4结论

本研究结果显示，颅脑损伤后血浆及海马中内皮素升高，降钙素基因相关肽下降，海马缺血，神经元坏死明显；PNS能够明显降低颅脑损伤后大鼠血浆及海马中的内皮素含量，升高降钙素基因相关肽水平，减少海马神经元坏死，且呈一定的量效关系，这可能是其在颅脑损伤后继发性脑损害过程中发挥脑保护作用的机制之一。

【参考文献】

[1]Ormatad H, Aass HC, Lund-Srensen N,etal.Serum levels of cytokines and creative protein in acute ischemic stroke patients and their relationship to stroke lateralization type and infarct volume[J]. J Neurol, 2011, 258(4):677-685.

[2]Waton RE, Supowit SC, Zhao H,etal. Role of sensory nervous system Vasoactive peptides in Hypertension[J]. Braz J Med Biol Res, 2002, 35(9) :1033-1045.

[3]王时龙, 丁花艳. TNF、ET、CGRP在急性颅脑损伤患者血液及脑脊液中的变化及意义[J]. 海南医学, 2013, 24(18):2759-2760.

[4]官明, 陈礼刚, 陈跃, 等. 依达拉奉对创伤性脑损伤患者血浆内皮素、降钙素基因相关肽、神经组织蛋白的影响[J]. 中国神经精神疾病杂志，2007,33(11):643-644.

[5]韩金安, 匡永勤, 周虎田,等. 三七总皂甙对家兔脑损伤后脑组织中丙二醛含量变化的影响[J].中国病理生理杂志, 2000,16(3):269-271.

[6]Feeny DM, Boyeson MG, Linn RT,etal. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat [J]. Brain Res,1981,211(1):67-77.

[7]贺石林,王键,王净净.中医科研设计与统计学[M].长沙:湖南科技出版社,2003:49.

[8]Cherian L, Hlatky R, Robertson CS. Comparison of tetrahydrobiopterin and L-arginine on cerebral blood flow after controlled cortical impact injury in rats [J]. J Neurosurg, 2004, 21(9):1196.

[9]罗大山, 邓峰. 脑氧摄取率变化对重型颅脑损伤患者预后影响的观察[J].西部医学,2007,19(5):821.

[10] 赵爱军, 杨立丰, 王守臣, 等. 经颅多普勒监测重度颅脑损伤患者的血流变化[J].西部医学,2010,22(10):1835-1836.

[11] 丁建军,李维平,付友增,等.ET-1、CGRP在颅脑损伤后脑血管痉挛中的作用[J].中华实验外科杂志,2002,19(4):326-327.

[12] 苑玉清,蔡博文,游潮. 急性重型颅脑损伤时内皮表和降钙素基因相关肽含量变化及其对动脉压的影响[J]. 中华急诊医学杂志,2004,13(7):476-477.

[13] 白亮. 颅脑损伤急性期患者的血糖和乳酸脱氢酶及C反应蛋白的水平变化及临床意义[J].中国全科医学，2011,14(5B)：1599-1600.

[14] 官明, 陈礼刚, 董劲虎, 等. 半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂z-DEVD-fmk对大鼠脑创伤后神经细胞凋亡及血浆血管内皮素、降钙素基因相关肽水平的影响[J].临床神经病学杂志,2014,27(3):207-209.

[15] 宋月英, 闰玉仙, 陈海生,等.三七总皂甙对缺血再灌注大鼠脑组织CaMKⅡ-βmRNA及蛋白的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(3):835-837.

[16] 刘旺华, 李花,周小青,等. 三七总皂甙对大鼠缺血再灌注海马细胞Ca2+及线粒体膜电位的影响[J].中华中医药学刊,2009,27(1):99-101.

Effects of Panax notoginseng on levels of endothelin-l and calcitongene related peptide in the plasma and hippocampus of rats with brain trauma

XU Gang, GONG Shouping, CUI Gang, et al

(DepartmentofNeurosurgery,TheAffiliatedSecondHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the change and the effect of Panax notoginseng (PNS) on the levels of endothelin-1 (ET-1) and Calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the plasma and hippocampus of rats with brain trauma. Method80 Wister rats were randomly divided into blank group, model group, PNS low dose group and PNS high dose group. The brain trauma model was established by improved Feeney’s method. ET-1and CGRP in the plasma and hippocampus of rats were determined by RIA. The pathological change of brain and hippocampus was observed with HE and Niss dyeing. Result Compared with that of the blank group, the levels of ET-1 in the plasma and hippocampus of of model group significantly increased(P<0.05),but the levels of CGRP in the plasma and hippocampus of model group significantly decreased(P<0.05). The levels of ET-1 and CGRP in the plasma and hippocampus of PNS low group and high dose group were significantly different(P<0.05). The levels of ET-1 and CGRP in the plasma and hippocampus of PNS high dose group vs PNS low dose group were significantly different(P<0.05). PNS could relieve the deterioration of brain cell morphology, meainwhile it could decrease the death amounts of neurons in hippocampus after rats with brain trauma. ConclusionPNS can significantly decrease the levels of ET-1, increase the levels of CGRP in the plasma and hippocampus and relieve secondly brain damage after brain trauma.

【Key word】Brain trauma; Endothelin; Calcitonin gene related peptide; Panax notoginseng saponins

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81271339)

通讯作者：崔刚，E-mail:cg6814@163.com

【中图分类号】R-33

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.004

(收稿日期：2016-02-02； 编辑：母存培)