超高效液相色谱-质谱法测定果蔬中三唑酮的方法研究

武　婷，张　洪，赵小珍（山西省分析科学研究院，山西太原　030006）



超高效液相色谱-质谱法测定果蔬中三唑酮的方法研究

武婷，张洪，赵小珍
（山西省分析科学研究院，山西太原030006）

摘要：建立了超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC- MS/MS）测定果蔬中三唑酮的方法。样品以乙腈匀浆提取，并采用氨基固相萃取柱（Sep- Pak Vac）进行样品的净化，采用超高效液相色谱柱WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）型分离，乙腈和0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱。三唑酮在1.0～100.0 ng/mL范围内，线性关系良好，回归系数R2为0.999 8，回收率达到84.9%～89.3%，精密度达到2.96%～3.53%。该方法操作快捷、提取效率高、重现性好、实用价值较高。

关键词：超高效液相色谱-质谱法；果蔬；三唑酮

0　引言

三唑酮（Triadimefon），商品名百菌酮、粉锈宁，是一种高效、低毒、持效期长、内吸性强的三唑类杀菌剂。喷施三唑酮后，它由茎叶吸收后可分布到全植株，一般认为其代谢产物三唑醇起主要的灭菌作用［1］。伴随着农药产品的增多和农药产品的滥用，农药对环境造成的危害日趋严重。国内外对三唑酮残留限量有较严格的规定，如在《欧洲药典》中规定植物药中最大允许残留限量（MRL）为0.1 mg/kg［1］。我国对三唑酮的控制也日益引起有关部门的重视，在2012年发布的中华人民共和国国家标准GB 2763—2012中就对三唑酮MRL做了相应的规定，三唑酮在稻谷、玉米中MRL为0.5 mg/kg，在小麦、油菜籽中的MRL为0.2 mg/kg，在棉籽、结球甘蓝、豌豆、梨、荔枝、香蕉中的MRL为0.05 mg/kg，在黄瓜、甜菜中的MRL为0.1 mg/kg，在苹果、柑橘中MRL 为1.0 mg/kg。

关于三唑酮的分析方法有多种报道，文献中对三唑酮的检测主要采用气相色谱法（GC）［1-2］、液相色谱法（HPLC）［2-3］、气相色谱-质谱联用法（GCMS）［4-10］和液相色谱-质谱联用法（LC- MS/MS）［11］。本方法建立了超高效液相色谱-质谱联用法（UPLCMS/MS）检测果蔬中三唑酮的方法，分离时间大大缩短，溶剂消耗量也减小到最低用量，具有更高的灵敏度和分离度，节约了试验成本，并做到了真正意义上的环境友好型方法，为果蔬中三唑酮的检测提供了有力的技术支持。

1　试验部分

1.1仪器与试剂

ACQUITY UPLC XEVO TQ型超高效液相色谱质谱联用仪，美国WATERS公司产品；Pipet- Lite XLS型移液器，美国Rainin Instrument公司产品；Retsch GM200型组织捣碎机，Germany公司产品；TGL-16M型高速离心机，湘智离心机公司产品产品；N- EVAP型氮吹仪，USA公司产品；Sep- Pak Vac型氨基固相萃取柱，SUPELCO，USA公司产品；RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品。

三唑酮（Triadimefon）对照品，购自国家标准物质中心；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，甲苯为优级纯，实验室用水为超纯水；氯化钠为优级纯，无水硫酸钠为分析纯，用前在650℃下灼烧4 h，贮于干燥器中，冷却后备用。

三唑酮标准溶液：精密称取三唑酮标准品0.1 000 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，此溶液1 mL相当于1.00 mg三唑酮。临用时，用乙腈稀释至所需的质量浓度。

1.2色谱条件

不同流动相色谱条件见表1。

表1　不同流动相色谱条件

色谱柱：WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）型；进样量：10 μL；柱温：40℃。

1.3质谱条件

电离模式：ESI+；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔流速：50 L/Hr；脱溶剂气流速：900 L/Hr；碰撞气流速：0.17 mL/min；母离子：294.2；子离子：197.1（定量离子），225.2；锥孔电压：25 V；碰撞能量：15，13 eV。

1.4样品预处理

1.4.1 提取

取20 g样品（精确至0.01 g）于80 mL聚丙烯离心管中，加入40 mL乙腈，用高速组织捣碎机在转速15 000 r/min下匀浆提取1 min，加入5 g氯化钠，再匀浆提取1 min，以转速3 800 r/min下离心5 min，取上清液20 mL（相当于10 g试样量），在40℃水浴中旋转浓缩至1 mL，待净化。

1.4.2 净化

在Sep- Pak Vac型柱中加入约2 cm高无水硫酸钠，并放入下接鸡心瓶的固定架上。加样前先用4 mL乙腈+甲苯（3+1）预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，并更换新鸡心瓶接收。再每次用2 mL乙腈+甲苯（3+1）洗涤样液瓶3次，并将洗涤液移入柱中。在柱上加上50 mL贮液器，用25 mL乙腈+甲苯（3+1）洗脱农药及相关化学品合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至净干。将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干，迅速加入1 mL的乙腈+水（3+2）混匀，经0.2 μm滤膜过滤，供UPLC- MS/MS分析。

1.5方法学试验

1.5.1线性关系

选择不含有三唑酮的西红柿为果蔬样品代表。准确称取20 g（精确至0.01 g）未添加三唑酮的西红柿匀浆液，准确加入三唑酮的对照品溶液，使样品中三唑酮的质量浓度为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL，分别对这些溶液进行UPLCMS/MS分析，记录MRM图，得峰面积，并对各溶液的峰面积和质量浓度进行线性回归分析，得到线性回归方程和相关系数。

1.5.2检出限与定量限

检出限与定量限是衡量方法灵敏度的指标之一。将对照品溶液逐级稀释，分别对这些溶液进行UPLC- MS/MS分析，记录MRM图中定量离子的信噪比，以3倍信噪比计算得出检出限，10倍信噪比计算得出定量限。

1.5.3回收率和精密度测定

选择不含有三唑酮的西红柿为果蔬样品代表。按照加样回收法低、中、高3个水平对空白样品进行加标，每个质量浓度平行6份，使西红柿样品中三唑酮的添加量为0.125，0.250，0.500 μg/kg，按照1.4方法进行样品处理。按照色谱-质谱方法进样，计算每个质量浓度下的回收率，同时计算相对标准偏差。

2　结果与分析

2.1线性关系

选用三唑酮的溶液质量浓度为1.0～100.0 ng/mL的样品溶液进样分析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。得到标准曲线为Y=2 091.3X- 778.58，R2=0.999 8。线性关系良好，完全符合方法学要求。

三唑酮的标准工作曲线见图1，三唑酮标准溶液的MRM见图2。

2.2检出限与定量限

对逐级稀释溶液中三唑酮的质量浓度进行分析，将所得MRM图中的色谱峰进行信噪比计算。质量浓度为0.5 ng/mL时，信噪比大于3倍空白信噪比，得出检出限为0.5 ng/mL。质量浓度为1.0 ng/mL时，信噪比大于10倍空白信噪比，得出定量限为1.0 ng/mL。

图1　三唑酮的标准工作曲线

图2　三唑酮标准溶液的MRM

2.3回收率与精密度

西红柿样品中三唑酮的回收率与精密度见表2。

表2　西红柿样品中三唑酮的回收率与精密度

西红柿样品中平均回收率为84.9%～89.3%。根据国家标准GB/T 27404—2008实验室质量控制规范食品理化检测中对检测方法确认的技术要求中，被检测组分浓度含量小于0.1 mg/kg时，回收率达到60%～120%，即符合方法学的要求。计算各质量浓度下平行6次的试验结果，计算相对标准偏差。

2.4实际样品分析

按试样方法对市场上购买的苹果、梨、西红柿、韭菜、黄瓜等共10批次蔬菜水果进行三唑酮残留量分析。结果表明，被测的10批次样品中，均未检出三唑酮。

3　结论

本研究建立了果蔬中三唑酮的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC- MS/MS）检测方法。通过线性关系、检出限与定量限、加标回收率和精密度试验等方法学考查，得出该法结果满意，完全符合方法学要求。该方法前处理简单、快速、准确，检出限低、灵敏度高、重现性好，能满足农药残留分析的要求，为果蔬中三唑酮的残留监控提供了有力的技术支撑。

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Study on Method of Determination of Triadimefon in Fruits and Vegetables by using Ultra High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

WU Ting，ZHANG Hong，ZHAO Xiaozhen
（Shanxi Academy of Analytical Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：A method for determination of triadimefon in fruits and vegetables is developed by using ultra high performance liquid chromatography- mass spectrometry（UPLC- MS/MS）. The samples are extracted by acetonitrile firstly and the extracts are cleaned using Sep- Pak Vac- SPE. The extracts are separated by a WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）utilizing gradient elution with acetonitrile and 0.1%formic acid. The linear relationship（R2=0.999 8）is fine in the concentration range of 1.0 to 100.0 ng/mL. The recoveries are in the range of 84.9%to 89.3%. The RSD is in the range of 2.96%to 3.53%. The method has a practical value with stable，simple，rapid，precise，high extraction efficiency and good reproducibility.

Key words：ultra high performance liquid chromatography - mass spectrometry；fruits and vegetables；triadimefon

中图分类号：TS255.7

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.042

文章编号：1671- 9646（2016）04b- 0040- 03

收稿日期：2016- 03- 24

作者简介：武婷（1982—），女，硕士，工程师，研究方向为食品添加剂的分析与检测。