醋酸艾司利卡西平片在比格犬体内的相对生物利用度

向志雄++刘成洪++谢建树

摘要 采用单剂量随机交叉实验设计，评价8只比格犬口服受试或参比醋酸艾司利卡西平片的相对生物利用度。用UPLC-MS/MS法测定血浆中的艾司利卡西林浓度，艾司利卡西平的线性范围为：1.0～1000.0ng/ml；定量下限可达1.0ng/ml；受试和参比制剂的主要药动学参数分别为：Tmax（1.72±1.2）和（1.50±0.9）h；Cmax（31300±14104）和（40088±18156）ng/ml，AUC0-1， （133121±60209）和（146926±61557）ng·h/ml，AUC0-∞（133171±60 207）和（147028±61593）ng·h/ml，tl/2（5.84±2.0）和（5.80±1.1）h。受试制剂艾司利卡西平的相对生物利用度为（106.1±102.6）%。结果显示：两制剂平均药动学参数无统计学差异。

关键词 醋酸艾司利卡西平片 超高效液相色谱·质谱联用法 药动学 相对生物利用度

中图分类号：R971.6； R969.1

文献标示码：A

文章编号：1006-1533（2016）01-0075-05

钠通道阻滞药醋酸艾司利卡西平片（eslicarbazepineacetate，la），是由葡萄牙的BIAL集团和其北美合作商Sunovion制药以及其欧洲市场合作伙伴Eisai制药共同开发的抗癫痫新药，它是艾司利卡西平（S-Iicarbazepine，1）的醋酸酯前药。临床上该药用于成人癫痫部分性发作（伴有或不伴有继发性全身发作）的辅助治疗，推荐的起始剂量为400mg，每日1次，1～2周后增至800mg，每日1次。国内外发表的有关1血药浓度的测定方法丰要有HPLC_UV、LC-MS和LC-MS/MS法，前处理方法有蛋白沉淀、液一液萃取，血浆需求量一般比较大（0.2-1.0ml），测定1的灵敏度较低（10～2000ng/ml）；有关比格犬血浆中1的超高效液相色谱一质谱联用测定方法，作者未见国内外任何文献报道。本实验遵照美国FDA指导原则，建立了快速、灵敏、专属性强的UPLC-MS/MS法，测定比格犬血浆样品中1的浓度，考察了单剂量口服la后比格犬体内的相对牛物利用度，为该制剂的临床应用提供参考。

1 仪器与试药

API4000 QTRAP型串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analystl.5.1数据处理软件（美国AppliedBiosystem公司）；Waters Acquity UPLC系统，包括二元输液泵，自动进样器，（美国Waters公司）；Valco2-Position型切换阀（美国Valco Instruments公司）。

1标准品（加拿大TRC公司，纯度98%，批号2-KMT-145-3）；艾司利卡西平-d4（2，内标，加拿大TRC公司，纯度98%，批号2-TMH-153-5）；受试la（上海医药集团股份有限公司，规格800mg，批号201309IOA）；参比la（葡萄牙Bial制药公司，规格800mg，批号GCSX）；乙腈和甲醇（Merck，色谱纯）；甲酸（CNW，色谱纯）；实验用水为Millipore超纯水；其余试剂均为市售分析纯级试剂。8只比格犬，雄性，体重8～9kg[上海交通大学农学院教学实验练习场，动物牛产许可证号SCXK（沪）2012-0005，动物合格证号2007000400308]。

2 方法

2.1 溶液配制

1储备液：精密称取1标准品5mg，加甲醇溶解，并制成质量浓度为5000μg/ml的1储备液。

内标工作溶液：精密称取2标准品lmg，加甲醇溶解，并制成质量浓度为1000μg/ml的2储备液，取适量内标储备液，用含0.1%甲酸溶液的甲醇稀释，获得浓度为20.0ng/ml的内标工作溶液。

系列浓度血浆样品：精密量取1储备液适量，用甲醇稀释得1浓度为20，18，6，2，0.6，0.2，0.04，0.02μg/ml的标准溶液。精密量取标准溶液各10μ1平行加入到190μ1比格犬空白血浆中，制得1浓度为1000、900、300、100、30、10、2和lng/ml的系列浓度血浆样品。

质控血浆样品：精密量取1储备液适量，用甲醇稀释得浓度为16，4和0.06μg/ml的标准溶液。精密量取标准溶液各10μl平行加入到190μ1比格犬空白血浆中，制得1浓度为800、200和3ng/ml的高、中、低质控血浆样品。

2.2 色谱质谱条件

2.2.1 色谱条件

色谱柱：BEHC₁₈（2.1mmxl00mm，1.7μm，Waters公司）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A），含0.1%甲酸的甲醇溶液（B）；梯度洗脱（表1）；流速0→1.2min，250μ/min；1.3→2.4min，400μI/min； 2.5→3.0min，250μI/min；柱温50℃；自动进样器温度4℃；进样量10μl。

2.2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子方式检测；扫描方式为多反应监测（MRM）；监测离子对m/z255.O→m/z194.2（1）和m/z250.2→m/z 198.1（2）；去簇电压（DP） 45V（I）和49V（2）；碰撞电压（CE） 29V（1）和30V（2）；碰撞室喷出电压（CXP） 12V；离子源电压（IS）5500V；离子源温度（TEM）600℃；雾化气（Gasl，N2）压力60psi；辅助气（Gas2，N2）压力60 psi；气帘气（CUR）压力20psi；碰撞气（CAD，N2）压力Medium。

2.3 实验方案

8只比格犬随机分成2组。受试和参比制剂剂量均为800mg/只。采用双周期交义试验设计，两次试验周期间隔10d。每周期试验给药前禁食12h，整个试验过程不禁水，给药后4h方可进食。每次试验均在比格犬清醒状态下给药，给药时以50ml水送服药物。分别于每周期给药前及给药后0.25、0.5、0.75、l、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72h取血2ml，置于肝素化离心管中，离心（6662g） 10 min，分离上层血浆，-80℃冰箱保存。

2.4 血浆样品处理

精密取血浆样品50μ1至1.5mlEP管中，加入500μl内标工作溶液，混匀后离心（25314g）10min，取上清450μ1，真空浓缩仪吹干。用100μl65%甲醇（含0.1%甲酸）进行复溶，进样。

2.5血浆样品分析方法考察

2.5.1 方法的专属性

以色谱保留时间和离子对定性确定1的色谱峰及其对应内标峰。分别取6份不同个体的比格犬空白血浆，除内标工作液改加含0.1%甲酸的甲醇外，其他按“2.4”项下方法处理，进样测定。取空白犬血浆、最低定量限（LLOQ，lng/ml）血样、空白犬血浆加1（200ng/ml）、比格犬给予l片la后0.25h的血样，均按“2.2”项下方法处理，分别进样，色谱图见图l。结果表明：内源性物质不干扰测定。

2.5.2线性关系

取系列浓度血浆样品，按“2.4”项下方法处理后进样分析。以血浆中待测物浓度c为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值R为纵坐标，用加权（W=I/c2）最小二乘法进行回归计算，求得回归方程分别为：R=0.0032c+0.0017，r=0.998，表明1在1.0-1000.0ng/ml范围内线形关系良好。1的LLOQ为1.0ng/ml。

2.5.3 准确度与精密度

取质控血浆样品，按“2.4”项下方法处理后进样分析。每个浓度各6份，分别测定3批，计算日内（n=6）、日间（n=3） RSD和方法回收率（表2）。

2.5.4 提取回收率和基质效应

按“2.4”项下操作，制备低、中、高3个浓度的对照品血浆，每个浓度6个样品。同时取6份不同个体的50μl空白比格犬血浆，除不加内标溶液外，按照生物样品前处理方法处理后，向获得的全部上清液中分别加入2.5μl的质控样品添加液和内标溶液，涡流混匀后，于真空浓缩仪吹干，100μl溶液（Milli-Q Water/甲醇（35∶65，v/v），含0.1%甲酸）进行复溶，3个浓度水平。进样10μl进行UPLC-MS/MS分析，获得相应峰面积，以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，1低、中、高3个浓度的提取回收率士RSD分别为：（90.2±12.76）%、（80.7±12.59）%和（84.5±3.80）%：2的提取回收率为（100.1±4.26）%。实验中对1和2的基质效应进行了考察，结果相对偏差RE均小于15%，表明血浆无明显基质效应存在。

2.5.5 灵敏度和稳定性试验

配制6份1质量浓度为lng/ml的LLOQ样品，按“2.2”项下操作后测定，计算LLOQ浓度测定方法的准确度与精密度。S/N>5，RSD=7.76%，方法回收率为（96.7±7.76）%，本实验分别考察了低、中、高浓度质控血浆样品在不同条件下的稳定性（n=6）。结果表明在上述条件下血浆样品均稳定（表3）。本实验还考察了储备液-20℃放置30d和工作溶液室温放置6h的稳定性，结果表明，储备液和工作液在规定的储存条件下稳定。

2.5.6 稀释效应验证试验

本方法中1的线性范围为1.0-1000.0ng/ml，对于浓度超出线性范围的样品，用空白比格犬血浆稀释后再测定，因此进行了稀释效应验证试验。配制1浓度为40000 ng/ml的6份血浆样品，精密吸取20μl，加入空白血浆980μl，混匀。然后从中取出50μl，按“2.2”项下操作后测定，结果准确度为108.7%，RSD=2.42%，表明血浆样品稀释对测定结果没有影响。

3 结果

8只比格犬口服la受试和参比制剂后的平均药时曲线见图2，采用Kinetica 5.1软件非房室方法计算比格犬给药后1的丰要药动学参数：达峰时间Tmax和达峰浓度Cmax采用实测值；药物浓度一时间曲线下面积AUC0-t采用梯形法计算值，t为最后一个可测定浓度样品的时间点；AUCO-∞按下列公式计算：AUCO-∞=AUC0-t+Ct/ke，Ct为最后一个可测定时间点的浓度，ke为消除速率常数；血浆消除半衰期t1/2=0.693/ke；相对牛物利用度F=（受试制剂AUC0-t/参比制剂AUC0-t）×l00%。采用配对t检验，比较给予受试或参比la制剂后的药动学参数的差异，Tmax采用非参数检验，其他参数经对数转换后进行检验。结果显示：经统计检验，药动学参数Tmax、Gmax、AUC0-t、AUCo和t1/2在受试与参比la制剂间无统计学差异（P>0.05）。

4 讨论

1）色谱条件为了提高分析灵敏度，改善峰形并缩短分析时间，分别尝试用甲醇和乙腈作为流动相中的有机相，结果表明前者背景噪音较低，且待测物的响应更稳定，在流动相中加入甲酸可使待测物的响应增加，峰形得到改善，同时采用内标2，有效避免离子抑制与内源性物质干扰。为了减少残留，在目标化合物出峰以后采用大流速冲洗系统。

2）血样样品处理文献报道的血浆样品处理方法有蛋白沉淀法、液一液萃取法等。液一液萃取法比沉淀蛋白处理繁琐，本实验在不影响灵敏度的前提下，采用了极其简便的蛋白沉淀法，并在优化沉淀条件时，对沉淀试剂进行了考察。血浆样品在不同体积甲酸作为酸化试剂的条件下，分别经甲醇、乙腈溶剂进行沉淀，通过UPLC-MS/MS进行分析，发现以500μl含0.1%甲酸的甲醇为沉淀试剂，提取上清，并用起始流动相稀释，提取回收率高且稳定。

3）受试参比制剂的相对牛物利用度由于母药经过体循环后浓度很低，所以测定丰要代谢物1，并计算其药动学参数。经过方法验证测得的受试参比制剂的药动学参数标准差有点偏大，其丰要原因是因为比格犬的个体差异大造成的。比较两制剂的药动学参数，表明两制剂药动学性质没有统计学差异。