发酵食品中降胆固醇益生菌的筛选及鉴定

高玉荣，刘立君，李本领，李大鹏（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆　163319）



发酵食品中降胆固醇益生菌的筛选及鉴定

高玉荣，刘立君，李本领，李大鹏
（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319）

摘要：以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平板分离、体外降胆固醇能力的测定及益生功能评价，筛选出1株胆固醇降解率为69.2%的益生菌菌株S- 59。该菌株不仅具有良好的耐酸能力、耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。经形态学、生理生化试验，将其鉴定为嗜酸乳杆菌。

关键词：发酵食品；降胆固醇；益生菌；筛选

随着生活水平的提高及膳食结构的变化，人们对高脂肪、高胆固醇食物的摄入逐渐增多，导致动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病患者的数量不断增加。因此，研究和利用具有降胆固醇功能的微生物以降低食品和人体血清中的胆固醇，对改善人们的健康水平有重要的意义［1］。在认识了降胆固醇对机体的有益功能后，国内外掀起了降胆固醇益生菌研究及应用的热潮。这些研究主要集中在降胆固醇益生菌的筛选和鉴定、降胆固醇机理，以及降胆固醇微生物制剂和降胆固醇保健食品的开发［2-3］。本文以酸菜、酸奶等发酵食品为原料，从中筛选具有降胆固醇功能的益生菌，并对筛选出来的益生菌通过形态鉴定、生理生化试验及16S rDNA序列分析进行菌种鉴定。

1　试验材料

1.1分离原料

酸奶、酸菜、发酵香肠，市售。

1.2 菌种

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，由黑龙江八一农垦大学食品学院微生物实验室提供。

2　试验方法

2.1乳酸菌的分离

将发酵香肠浸提液、酸菜汁、酸奶进行10倍梯度稀释，分别吸取1×10-5，1×10-6，1×10-7的稀释液0.1 mL于MRS- CaCO3固体培养基平板上，涂布分离，于37℃条件下培养24 h。将具有明显溶钙圈的单菌落挑至MRS固体斜面上，37℃培养24 h。

2.2体外降胆固醇乳酸菌初筛

将分离出的斜面菌种置于MRS液体培养基中，于37℃条件下培养12～14 h，进行活化。按3%的接种量接种到含有胆固醇的MRS- CHOL培养基［1］中，于37℃条件下培养72 h后测定其中的胆固醇含量［4］。2.3体外降胆固醇乳酸菌的复筛

将初筛获得的胆固醇降解率较高的菌株进行复筛，将活化的菌悬液按3%的接种量分别接种含有0.2 mg/mL胆固醇的MRS液体培养基中，于37℃条件下培养72 h后测定胆固醇含量［4］。

2.4体外降胆固醇乳酸菌的益生功能评价

2.4.1菌种耐酸性能评价

挑取1～2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基中，于37℃条件下培养12～14 h。取5 mL菌液以转速4 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入10 mL经盐酸（1 mol/L）调节pH值为2.0的生理盐水中，于37℃条件下培养4 h后，通过平板计数法测细胞存活率［5］。

2.4.2菌种耐胆盐性能评价

挑取1～2环斜面菌种到10 mL MRS液体培养基中，于37℃条件下培养12～14 h。取5 mL菌液以转速4 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入10 mL 含0.3%猪胆盐的生理盐水中，于37℃条件下培养4 h后，通过平板计数法测定细胞存活率［5］。

2.4.3菌种疏水性评价

将斜面菌种进行活化，接种到MRS液体培养基中，于37℃条件下培养14 h后，以转速4 000 r/min离心10 min，收集菌体细胞，测定菌体细胞的疏水性。

3　结果与分析

3.1发酵食品原料中降胆固醇微生物的筛选

3.1.1乳酸菌的分离

从酸菜、发酵香肠和酸奶中，采用MRS固体培养基，通过平板分离法分离出120株具有明显溶钙圈且表面光滑乳白色的单菌落。

3.1.2降胆固醇微生物的初筛

降胆固醇乳酸菌的初筛见表1。

表1　降胆固醇乳酸菌的初筛

按照5%的接种量将活化菌株接种到含有胆固醇的MRS液体培养基中，于37℃条件下培养72 h后，测定体外降胆固醇的能力，共有18株菌株的降胆固醇能力大于40%。

3.1.3降胆固醇微生物的复筛

降胆固醇乳酸菌的复筛见表2。

表2　降胆固醇乳酸菌的复筛

对初筛出的18株菌株进行复筛，确定降胆固醇能力大于60%的菌株4株。

3.2降胆固醇微生物益生功能评价

（1）耐酸性能的测定。

耐酸能力的测定见表3。

表3　耐酸能力的测定

由表3可知，4株菌株在酸性环境下存活率大于30%，其中S- 59在pH值为2的酸性环境下培养4 h后存活率最高为48.8%。

（2）耐胆盐性能的测定。

耐胆盐能力的测定见表4。

表4　耐胆盐能力的测定

由表4可知，4株乳酸菌在胆盐0.3%的生理盐水中培养4 h后存活率最高的菌株为S- 61，存活率为32.2%；其次是菌株S- 59，存活率31.8%，但二者差异不显著。

（3）疏水性的测定。

疏水性的测定见表5。

表5　疏水性的测定

由表5可知，菌株S- 59和S- 61具有较高的疏水率，分别为31.6%和28.7%；资料报道疏水率介于20%和50%为中度疏水，因此菌株S- 59和S- 61细菌表面的疏水性达到了中度疏水，作为益生菌可以在肠道黏膜表面黏附并定殖。

由以上益生功能及发酵性能评价结果看出，S- 59菌株不仅具有较强的降胆固醇能力，而且有较强的耐酸、耐胆盐能力和疏水性。因此，对S- 59菌株进行后续研究。

3.3菌种鉴定

3.3.1形态鉴定

（1）个体形态鉴定。

S- 59菌株显微形态（10×100）见图1。

由图1可知，S- 59菌株的革兰氏染色结果为紫色，是革兰氏阳性（G+）菌；形态为杆状，单个生长为主。

图1　S- 59菌株显微形态（10×100）

（2）菌落特征观察。

S- 59菌落形态见图2。

图2　S- 59菌落形态

由图2可知，S- 59菌株的菌落直径为1～2 mm，呈圆形，表面凸起，微白色，湿润且边缘整齐。

3.3.2生理生化试验

生理生化鉴定结果见表6。

根据《常用细菌系统鉴定手册》，初步将菌株鉴定为嗜酸乳杆菌。

4　结论

（1）以发酵香肠、酸菜及酸奶为原料，通过平板分离、体外降胆固醇能力的测定获得4株降胆固醇能力大于60%的菌株。

表6　生理生化鉴定结果

（2）通过益生功能评价，筛选出1株胆固醇降解率为69.2%的益生菌菌株S- 59，不仅具有良好的耐酸能力和耐胆盐能力，而且具有较强的疏水性。

（3）经形态学、生理生化试验，将益生菌菌株S- 59鉴定为嗜酸乳杆菌。

参考文献：

［1］李昵．降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机理研究［D］．厦门：集美大学，2012.

［2］王春光，张雪，李达，等.酸菜来源植物乳杆菌的分离鉴定与耐受性研究［J］.食品科技，2010（10）：35-38.

［3］靳志强，王延祥，李平兰，等．植物乳杆菌耐酸耐胆盐的体外试验及其降胆固醇作用［J］．中国食品学报，2009，9（5）：24-28．

［4］中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所. GB/T 5009.128—2003，食品中胆固醇的测定［S］.北京：中国标准出版社，2004．

［5］杜连群.工业微生物学实验技术［M］．天津：天津科学技术出版社，1992：47-51．◇

Screening and Identification of Probiotics with Degrading Cholesterol Ability

GAO Yurong，LIU Lijun，LI Benling，LI Dapeng
（Food College，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Abstract：Using fermented sausage，sauerkraut juice，yogurt as materials，a probiotic strain of S- 59 with 69.2%of cholesterol degrading rate is screened by the plate separation，evaluation of determination and probiotic function. The strain has not only good acid resistance ability，bile salt tolerance ability，but also the ability of hydrophobic. By the morphological，physiological and biochemical experiments，the strain is identified as Lactobacillus acidophilus.

Key words：fermented food；degrading cholesterol；probiotic；screen

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.041

文章编号：1671- 9646（2016）04b- 0037- 03

收稿日期：2016- 03- 03

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究（面上）项目（12541585）。

作者简介：高玉荣（1970—），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为食品微生物与发酵工程。