胃黏膜组织TNF- α及iNOS表达水平与胃炎发病及细胞凋亡的相关性研究

陈东

(长沙市第一医院 急诊科,湖南 长沙　410005)

胃黏膜组织TNF-α及iNOS表达水平与胃炎发病及细胞凋亡的相关性研究

陈东

(长沙市第一医院 急诊科,湖南 长沙410005)

[摘要]目的：探讨肿瘤坏死因子α(TNF- α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与胃炎发病及细胞凋亡的相关性。方法：选取2012年2月至2014年3月间收治的112例胃炎患者作为研究组,56例健康受检者作为对照组。所有受检者入院次日进行血压、心率、肝功能、血常规等常规项检查。研究组患者接受TNF- α、iNOS以及细胞凋亡检查,再将患者按照病情严重程度分为轻度、中度、重度3组,比较组间差异；同时采用TUNEL法检测患者胃黏膜组织的细胞凋亡情况,并采用Pearson相关性分析研究TNF- α及iNOS表达与胃炎发病和细胞凋亡的相关性。结果：(1) 患者病情越严重TNF- α与iNOS水平越高,均明显高于健康对照组。(2) 凋亡细胞形态、大小、染色较正常细胞均有明显不同；同时,TNF- α≥1.0 ng·mg-1的阳性细胞指数(AI)显著高于TNF- α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100个·mm-2时AI显著高于iNOS<100 个·mm-2,TNF- α和iNOS不同亚组之间AI差异均有统计学意义,P<0.05。(3) 患者TNF- α和iNOS均与胃炎发病和细胞凋亡呈正相关,差异具有统计学意义。结论：TNF- α和iNOS的过量分泌可能引发胃炎患者胃黏膜的炎症反应,二者还可能诱导胃黏膜细胞凋亡。

[关键词]肿瘤坏死因子α； 诱导型一氧化氮合酶； 胃炎； 细胞凋亡

胃炎是一种常见的消化系统疾病,可由多种不同病因引起,常伴有黏膜炎症反应或上皮组织损伤,临床表现为上腹胀、呕吐、嗳气、食欲不振、反酸等[1]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)由激活的巨噬细胞分泌,具有显著的抗肿瘤活性,是一种直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子[2]。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是一种存在于神经元及免疫细胞中的同工酶,可在细胞受到刺激时被激活生成大量NO,协助巨噬细胞对抗病原体[3]。研究表明,胃炎患者胃黏膜损伤及继发产生的细胞凋亡与上述二者有关。因此,本研究探讨了TNF-α和iNOS的表达与胃炎发病及细胞凋亡的相关性[4]。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究对象为112例胃炎患者和56例健康受检者,分别作为研究组和对照组。研究组男65例,女47例,平均年龄(36.7±13.7)岁；对照组男30例,女26例,平均年龄(38.8±11.4)岁。病例纳入标准：(1) 所有患者经病理学检查确诊为胃炎；(2) 受检前未服用其他任何抗生素类、质子泵抑制剂等含硝基类药物。病例排除标准：(1) 合并严重脏器功能性衰竭者；(2) 不能配合者；(3) 严重精神疾病者。试验过程已通知所有患者及其家属,并签署知情同意书。两组基本资料差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。

表1基本资料比较

Tab 1Comparison of basic data

组 别男∶女平均年龄/岁病程/年心率/次·min-1血压/mmHg研究组65∶4736.7±13.73.5±2.374.2±5.789.4±6.3对照组30∶2638.8±11.4-73.5±4.887.8±5.2t/χ2值1.4621.102-1.7461.635P值>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

1.2方法

两组入院次日进行血压、心率等常规项检查。禁食10 h后于距幽门2.5 cm处的大弯、小弯、前壁、侧壁各取2块黏膜组织,分别用于TNF-α、iNOS的检测。将研究组患者按照病情严重程度分为轻度、中度、重度3组,比较组间TNF-α、iNOS差异,同时分析其与胃炎发病和细胞凋亡的相关性。

1.3检查指标及测定方法

1.3.1TNF-α的测定取胃黏膜组织洗涤干净后称重,加入生理盐水后粉碎,3 500 r·min-1离心10 min取上层液,-4 ℃以下冷藏保存待测。采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TNF-α水平,TNF-α水平(ng·mg-1)=TNF-α测得值(ng)/组织湿重(mg)。ELISA试剂盒由上海博谷生物科技有限公司提供；所使用仪器为全自动酶联免疫分析仪(北京欧蒙生物技术有限公司)。

1.3.2iNOS的测定采用免疫组化方法测定iNOS,步骤如下：(1) 切片常规脱蜡至水；(2) 尿素消化30 min；(3) 1%H2O2封闭内源酶30 min；(4) 加入羊血清37 ℃下保温30 min；(5) 滴加一抗4 ℃12 h；(6) 分别滴加生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物,37 ℃下依次保温40 min；(7) 以DAB显色,苏木素复染,常规封片；(8) 黄色或棕黄色阳性信号出现于细胞质。400倍光镜下观察相对染色较强、阳性细胞较多的视野, 统计阳性染色细胞数目,iNOS(个·mm-2)=阳性染色细胞数目/视野面积。

1.3.3细胞凋亡的检测采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,步骤如下：取样后以4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,脱蜡入水,3%H2O2处理10 min,TBS 1∶200稀释、Proteinase K消化、TBS洗涤,然后依次加标记缓冲液、封闭液、抗体稀释液后以DAB显色,苏木素复染,最终洗涤脱水封片,于显微镜下观察。细胞核中可见棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。以阳性细胞指数(AI)评价细胞凋亡情况：每张切片随机选取5个400倍视野,每个视野至少1 000个细胞,各个视野下阳性细胞数占总细胞数的比值的均值即为AI(%)。

1.4病情判断标准

所有患者根据胃黏膜的炎症程度将病情分为轻度、中度、重度：(1) 重度：全黏膜层几乎完全被炎症细胞浸润,并伴有黏膜上皮细胞坏死、变性等；(2) 中度：炎症细胞浸润面积为全黏膜层的1/3到2/3；(3) 轻度：炎症细胞浸润较轻,不超过全黏膜层的1/3[5]。

1.5统计学处理

本研究采用SPSS 17.0进行数据处理。计数资料以率表示,采用χ2检验；计量资料采用t检验,采用Pearson检验进行相关性分析。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2结果

2.1TNF- α及iNOS与病情严重程度相关性

患者病情越严重TNF-α与iNOS水平越高,且均明显高于健康对照组,差异有统计学意义,P<0.05,详见表2。

2.2TUNEL实验结果

胃炎患者凋亡细胞体积小,细胞核染成棕色,形态呈多种不规则状,大小不一,多分布于腺体各处。非凋亡细胞未见体积浓缩,细胞呈蓝色,细胞核较大,形态多呈类圆形或椭圆形,大小较一致。健康对照组胃炎黏膜标本少见凋亡细胞,主要分布于黏膜表层。TNF-α≥1.0 ng·mg-1的AI显著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 个·mm-2时AI显著高于iNOS<100 个·mm-2,TNF-α和iNOS不同亚组之间AI差异均有统计学意义,P<0.05。详见表3。

表2TNF-α及iNOS与病情严重程度相关性

Tab 2Correlation between TNF-α, iNOS and illness severity

组 别nTNF-α/ng·mg-1iNOS/个·mm-2轻度组550.57±0.1268.2±25.3中度组331.14±0.25122.7±34.6重度组241.92±0.17147.5±31.5对照组560.38±0.0810.5±2.1F组4.8698.274P组<0.01<0.01

表3各组患者AI比较

Tab 3Comparison of AI of patients in each group

指 标nAI/%t值P值TNF-α/ng·mg-1≥1.04215.34±1.36<1.07011.45±1.923.759<0.05iNOS/个·mm-2≥1004813.54±0.94<1006410.76±1.025.346<0.05

2.3TNF- α和iNOS与胃炎发病、细胞凋亡的相关性

患者TNF-α和iNOS均与胃炎发病和细胞凋亡呈正相关,差异具有统计学意义,见表4。

表4相关性分析

Tab 4Correlation analysis

指 标胃炎发病细胞凋亡r值P值r值P值TNF-α0.6950.0030.7370.006iNOS0.5380.0020.7020.005

3讨论

TNF-α是由巨噬细胞、T淋巴细胞和NK细胞产生的细胞因子。机体在疾病状态下,TNF-α等炎症因子升高,可导致中性粒细胞移动,诱导其发生黏附及细胞穿出,干扰胃黏膜内皮细胞的功能,使血流减少,从而造成胃黏膜损伤[6]。此外,TNF-α甚至可导致氧自由基的产生,并使溶酶体破裂,引起细胞凋亡。幽门螺杆菌感染时则可引起胃黏膜组织损伤,并激发炎症性因子TNF-α的分泌,加剧组织损伤。

一氧化氮(NO)是人体内的一种具有生物活性的分子[7],其主要来源于食物摄入的无机氮转化和NO合酶。 iNOS可调节NO,而iNOS诱导产生的大量NO即为其产生病理作用的基础,在多种疾病发生发展的过程扮演重要角色。大量研究[8]表明,当受到各种内外刺激因素作用后iNOS表达显著增加,促使NO过量表达,可产生促炎促肿瘤的病理作用。研究[9- 10]发现,抑制iNOS的表达或NO的产生可有效抑制胃炎和胃癌的发生。因此,胃黏膜炎症反应可诱导iNOS的表达,iNOS的过度表达也会诱发胃炎的发生并加重病情。

本研究结果显示,TNF-α与iNOS水平与患者病情有一定联系,病情越严重TNF-α与iNOS水平越高,表2显示轻、中、重度组均明显高于健康对照组。同时,胃炎患者胃黏膜细胞有明显细胞凋亡现象。细胞凋亡是指在某些生理或病理条件下,细胞受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的死亡过程[11]。一般情况下细胞凋亡与增殖处于动态平衡状态,维持组织的正常结构和功能,胃黏膜上皮细胞凋亡异常可导致胃黏膜病变的发生[12]。本研究中胃炎患者凋亡细胞形态、大小、染色较正常细胞均有明显不同；将患者分别按照TNF-α与iNOS水平各分为两个亚组,发现TNF-α≥1.0 ng·mg-1时的AI显著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 个·mm-2时AI显著高于iNOS<100 个·mm-2,TNF-α和iNOS不同亚组之间AI差异均有统计学意义,P<0.05,推断TNF-α与iNOS水平的提高可能是细胞凋亡的诱因[13]。另外,Pearson相关性分析显示患者TNF-α和iNOS均与胃炎发病和细胞凋亡呈正相关,可见患者TNF-α和iNOS表达与胃炎发病和细胞凋亡有显著关联[14]。

综上所述,胃炎患者胃黏膜的炎症及发病可能与TNF-α和iNOS的分泌有关,TNF-α和iNOS的分泌还可能诱导胃黏膜细胞凋亡,其具体作用靶点和机制尚不明确,有待进一步研究[15]。

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Study on the relation of the expression of TNF-α,iNOS with apoptosis and gastritis

CHEN Dong

(DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChangshaCity,Changsha410005,China)

[Abstract]Objective： To study the relationship of the expression of TNF- α, inducible nitric oxide synthase(iNOS) and with apoptosis and gastritis. Methods: 112 patients with gastritis as a study group and 56 healthy volunteers of the same age as a control group were selected. All patients’ liver function, blood routine, blood pressure and heart rate were examined the next day in the hospital. Next, the study group was furthermore divided into 3 groups according to illness severity, the levels of TNF- α and iNOS were compared. Apoptosis was detected by TUNEL assay. Finally, Pearson correlation analysis methods were used to analyze the correlation on iNOS, TNF- α with gastritis and apoptosis. Results:(1) The more severe the disease, the higher the levels of iNOS and TNF- α would be. Moreover, both iNOS and TNF- α levels were significantly higher than those in the control group. (2) Apoptotic cells were significantly different from normal cells in morphology, size and TUNEL staining. At the same time, when TNF- α ≥1.0 ng·mg-1, AI was significantly higher than that when TNF- α<1.0 ng·mg-1. When iNOS≥100 mm-2, AI was significantly higher than that when iNOS<100 mm-2. (3) Both iNOS and TNF- α levels positively correlated with the incidence of gastritis and apoptosis with significant differences. Conclusion: Inflammatory reaction of gastric mucosa for patients with gastritis may be related to the secretion of TNF- α and iNOS and they may induce apoptosis of gastric mucosal cells.

[Key words]tumor necrosis factor α; inducible nitric oxide synthase; gastritis; apoptosis

[收稿日期]2015- 10- 12[修回日期] 2016- 02- 16

[作者简介]陈东(1978-),男,湖南长沙人,副主任医师,医学硕士。E- mail:83547459@qq.com

[中图分类号]R573.3; R329.25

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)03- 0370- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．017

[引文格式] 陈东.胃黏膜组织TNF-α及iNOS表达水平与胃炎发病及细胞凋亡的相关性研究 [J].东南大学学报:医学版,2016,35(3):370- 373.

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