马齿苋水提醇沉液对大肠杆菌体内外抗菌试验

2016-06-13周孝琼王华

长江大学学报(自科版) 2016年9期

关键词：大肠杆菌马齿苋

(周孝琼,王华

(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；福建省预防医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩364012)

陈慧芳，李炳贵，潘灿阳,邱灵珊

(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012)

马齿苋水提醇沉液对大肠杆菌体内外抗菌试验

(周孝琼,王华

(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；福建省预防医学与兽医生物技术重点实验室，福建龙岩364012)

陈慧芳，李炳贵，潘灿阳,邱灵珊

(龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012)

[摘要]为了开发利用绿色中草药马齿苋(Portulaca oleracea L.)，进行了马齿苋水提醇沉液对大肠杆菌的体外抗菌试验和人工感染肉兔大肠杆菌病的防治试验，并测定血清中的总蛋白、白蛋白和球蛋白。结果表明，马齿苋提取物浓度在0.50、1.00、2.00g/mL时，对大肠杆菌表现为中度敏感，且随浓度的升高，抗菌效果增强；可显著提高受大肠杆菌攻击肉兔的存活率，且预防效果优于治疗效果；血清中蛋白含量预防组、治疗组均比健康组和模型组高。可见马齿苋水提醇沉液的体内、体外抗菌效果表现基本一致，能抵抗大肠杆菌的感染，增强机体的抗病能力。

[关键词]马齿苋(Portulaca oleracea L.)；水提醇沉液；大肠杆菌；体内外抗菌

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为马齿苋科马齿属的一年生肉质草本植物，广泛分布于温带和热带地区，在我国最为常见，是一种药食同源的植物，具有清热解毒、凉血止血的功效，民间广泛用于治疗腹泻病[1,2]。肉兔大肠杆菌病又称粘液性肠炎，是由致病性大肠杆菌及其产生的毒素所引起的一种暴发性肠道性疾病，当饲养管理不当、气候环境突变或患某些传染病、寄生虫病时引起抵抗力低下而发病。该病无明显的季节性，以20日龄至4月龄仔兔易感，尤其是20日龄到断奶前后发病率最高，以水样或胶冻样和严重脱水为主要特征。该病可经消化道传播引起大批死亡，造成严重的经济损失。本研究采用马齿苋水提醇沉液对大肠杆菌进行体外抗菌试验和对肉兔进行体内防治试验，同时对肉兔一些血液生化指标进行分析，以期为马齿苋的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

中药材马齿苋采自福建省龙岩市东肖镇田野，秋季全草采收，水洗，切碎于50℃烘箱中烘干备用。大肠杆菌菌种由龙岩学院动物医学研究所从接诊的病兔中分离纯化并鉴定为兔大肠杆菌。

试验动物为2月龄加利福利亚兔,共32只，公母各半，体重(2.0±0.2)kg,由福建省龙岩市肉兔养殖场提供。

试验LB培养基购自杭州滨和微生物试剂有限公司,总蛋白(产品编号：98-24018-US)、白蛋白(产品编号：98-24000-US)试剂盒购自北京安普生化科技有限公司。

试验仪器旋转蒸发仪N-1100为上海爱朗仪器有限公司产品，一体式超纯水系统labtower15EDI为赛默飞世尔科技公司产品，电子灭菌试验装置HVE-50为日本株式会社平山制作所产品，电子分析天平AL104-1C为梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品，血液生化分析仪IDEXX-VeTest为美国爱德士公司产品。

1.2方法

1.2.1家兔的饲养管理

采用漏粪底板的笼养方式，不含预混料的颗粒饲料喂养，自由采食、饮水。

1.2.2提取液的制备

采用水提取醇沉淀法，将马齿苋10g分别用10、8、6倍量超纯水浸泡蒸馏煮提3次，第一次回收蒸馏液，去渣，合并3次滤液，4层纱布过滤，经旋转蒸发仪浓缩至10mL。用75%乙醇醇提，调节pH至6.8～7.2，冰箱冷藏浸提48h后，滤纸过滤去除沉淀物质，旋转蒸发仪回收乙醇，冷却后再用85%乙醇醇提，重复以上操作，回收乙醇，最后加入1mL蒸馏成分，同时用0.5mL吐温-80和无菌水调节至10mL，即得1g/mL的浓缩液，高压蒸汽灭菌备用[3]。

1.2.3菌种的复壮与扩增

将大肠杆菌接种于LB固体培养基上，37℃培养18～24h，复壮后，用接种环取菌种一环置于LB液体培养基内，37℃培养24h，再用肉汤液稀释，使菌液浓度每毫升含菌量为9×108，备用[4]。

1.2.4体外抗菌试验

采用牛津杯法，取菌液100μL置于LB琼脂平板表面，用涂布器反复涂布均匀后置于37℃恒温箱中10min，表面干燥后取出，在每个平板上等距离平放打有标记的牛津杯6只，每只杯内分别加入等量的不同浓度的药液240μL,于37℃培养24～48h[5],每种浓度设置6个重复，求平均值。结果判断标准：抑菌直径≥20mm为极敏，用“”表示；15～19mm为高敏，用“”表示；10～l4mm为中敏，用“”表示；10mm 以下为低敏，用“+”表示；无抑菌圈为耐药[6]。

1.2.5体内抗菌试验

在预饲养期间将家兔分为4组，预防组、治疗组、模型组和健康组，每组各8只。健康组不致病不用药；预防组、治疗组、模型组每只家兔腹腔注射2mL的大肠杆菌菌液。模型组致病后不用药；预防组致病前1周给药，肌肉注射，1次/日，1mL/kg体重，用药7d，致病后再用药7d；治疗组致病同时给药，肌注，1次/日，2mL/kg体重，用药7d。观察10d，统计发病数、死亡数和存活数。

1.2.6试验兔血液中蛋白含量的测定

在接种大肠杆菌后的第3d，心脏采血2mL,离心取血清，用全自动血液分化分析仪检测血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量。

1.3数据分析与处理

所得数据采用SPSS18.0软件的0ne-WayANOVA法进行方差分析.差异显著后进行Duncan氏多重比较，以P<0.01(差异极显著)，P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准，结果用平均值±标准误差表示。

2结果与分析

表1　马齿苋提取液对大肠杆菌的体外抑菌效果

注：“”表示中敏,“+”表示低敏。

2.1体外抑菌试验

马齿苋水提醇沉液的体外抑菌试验结果见表1。

由表1可知，马齿苋提取物浓度在2.00、1.00、0.50g/mL时，对大肠杆菌表现为中敏；浓度为0.25g/mL时，表现为低敏。

2.2体内抑菌试验

统计各组兔的发病情况，结果见表2。

表2　提取物防治试验兔发病和死亡情况

由表2可知，试验结束时，模型组家兔死亡率为62.5%，说明此次人工感染肉兔大肠杆菌病的模型是成功的。预防组和治疗组的存活率分别为75.0%和62.5%，明显高于模型组的37.5%。说明马齿苋提取液对肉兔大肠杆菌病有一定的防治作用，且预防效果优于治疗效果。

2.3各组试验兔血液中的蛋白含量

利用SPSS软件对各组试验兔的血液蛋白检测结果进行统计分析，结果见表3。

表3　各组试验兔血液中的蛋白含量　g/L

注：同列数据上标小写字母相同的表示两者差异不显著(P>0.05)，小写字母不同的表示两者差异显著(P<0.05)。

由表3可知，与健康组比较，预防组与治疗组总蛋白显著升高(P<0.05)；白蛋白预防组显著高于健康组(P<0.05)；球蛋白治疗组显著高于健康组(P<0.05)。模型组TP、ALB、GLB与健康组差异不显著，但都略有升高；预防组和治疗组的TP、ALB、GLB与模型组差异不显著，但均略有升高。

3讨论

1)马齿苋性寒，味甘酸；入心、肝、脾、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效[1]。现代药理研究表明马齿苋具有抑菌、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等多种功用[7]。本研究结果表明，马齿苋提取液对大肠杆菌在体内外均表现出一定的抑菌作用。在提取物浓度为0.50g/mL时，对大肠杆菌表现为中度敏感，而黄修奇[8]和侯俊然等[9]研究的结果是高度敏感，这可能与马齿苋的产地、提取方法等有关，其原因有待进一步探讨。但马齿苋水提醇沉液在动物抗感染试验中，却表现出了明显的防治效果，而且预防效果优于治疗效果，说明马齿苋提取物可显著提高受大肠杆菌攻击肉兔的存活率，能改善动物机体的免疫机能和提高动物防御疾病能力。

2)血液生化指标是反映物体内物质代谢和某些组织器官机能状态变化的标志，并被广泛应用于研究中[10]。血清固体成分中含量最多的一类物质是血清总蛋白，它包括白蛋白和球蛋白2类，具有维持血管内正常胶体渗透压和酸碱度、运输多种代谢物、调节被运输物质的生理作用等多种功能，并与机体的免疫功能有着密切关系[11，12]。本研究中，模型组攻毒后食欲下降，拉稀，导致血清中水分减少，使TP、ALB、GLB浓度相对增高。使用马齿苋提取物防治，能使血清中蛋白含量升高，说明马齿苋提取物中有效成分有利于机体内蛋白质的合成，调控蛋白质代谢，能抵抗大肠杆菌的感染，增强机体抗损伤的作用。

3)临床上常用抗生素类药物来防治肉兔大肠杆菌病，虽能取得较好的效果，但易造成耐药性和胃

肠道菌群紊乱，危害机体健康。长期大量使用会造成药物残留，影响食品安全，危害人类健康。中草药含有抗菌杀菌物质、免疫活性物质、改善酶活性物质、有机酸及解毒和促进毒素排泄的物质等[13]。在养殖生产实践中，要坚持“养重于防、防重于治”的原则，在饲料中添加绿色无污染的中草药添加剂，减少肉兔大肠杆菌病的发生。

[参考文献]

[1]江苏新医学院.中药大词典[M].上海:上海科学技术出版社,1997:289.

[2]战兴花,田英林.马齿苋的药用价值[J].中国林副特产,2000,(1):55.

[3]南京药学院.药剂学[M].北京:人民卫生出版社,1978:269.

[4]钟秀会.中兽医学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2003:55.

[5]中国药典委员会.中国药典1995年版二部附录[S].

[6]李利红,陈忠杰,卢婷婷,等.几种香料植物提取物对大肠杆菌抑制作用的试验[J].中国兽医杂志.2013,49(6):54～56.

[7]冯津津.马齿苋的化学成分及药理作用研究进展[J].云南中医中药杂志,2013,34(7):66～68.

[8]黄修奇.马齿苋抗菌试验[J].中国兽医杂志,2010,46(6):59～60.

[9]侯俊然,范迎.马齿苋体外抗感染性腹泻菌群的作用研究[J].中外医疗,2010,(28):29.

[10]刘荣欣,鲁改儒,郭吉勇.加味白头翁汤对人工感染大肠菌肉仔鸡血液生化指标的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2011,(17):115～117.

[11]贾仁勇,李超,殷中琼,等.青刺果多糖对鸡血清抗体和血液生化指标的影响[J].安徽农业科学,2008,36(17):7247～7248,7481.