南方红豆杉组织培养体系优化

2016-06-13郄亚微

长江大学学报(自科版) 2016年9期

关键词：愈伤组织组织培养优化

郄亚微

(广安职业技术学院建筑与城市规划系，四川广安 638000)

南方红豆杉组织培养体系优化

郄亚微

(广安职业技术学院建筑与城市规划系，四川广安 638000)

[摘要]为建立南方红豆杉(Taxus chinensis)愈伤组织的高效诱导体系，提高红豆杉愈伤组织的诱导率和成活率，分别对南方红豆杉愈伤组织诱导的培养基、外植体接种方法、植物生长调节剂、pH进行优化试验，结果得出：最适宜的培养基为B5改良型、最佳接种方法为无叶茎段正插入培养基、添加2.0mg/L2，4-D或1.0mg/LNAA、pH控制在6左右，可以分别有效地提高红豆杉愈伤组织的诱导率和成活率。

[关键词]南方红豆杉(Taxus chinensis)；组织培养；愈伤组织；优化

红豆杉(Taxuschinensis)是一种珍稀的裸子植物，具有非常重要的药用价值和经济价值，其富含的紫杉醇是有效的癌症治疗药物，近年来随着对紫杉醇的需求增加，传统的种植方式提供的紫杉醇已经无法满足目前药用的需要。如何采用科学的方法对红豆杉组织进行快速培养和大量生产，以大量获得紫杉醇，满足药用需求，成为了目前医疗药材生产中急需解决的问题[1]。

植物组织培养技术是指在无菌的条件下，将植物组织置于培养基内，并将培养基放置到适宜的环境中进行连续的培养得到新的组织[2]，这种技术非常适合大批量的生产和培育特定的植物组织和幼苗，被广泛地应用于生物、农业和医药等科技领域的相关研究中。早在20世纪中期美国就采用组织培养技术成功地取代了传统的种植繁殖培育出了芹菜幼苗[3]，并且在后续研究中成功地应用到多种植物的幼苗和组织培养中，给农业育种带来了革命性的变化[4]。到20世纪末，德国和日本就已经利用植物组织培养技术生产次生代谢物，这一技术后来被广泛应用于各种稀有植物类药物的生产，极大地降低了稀有药物的价格，有效地促进了医药生物技术的发展和进步[5]。植物组织培养技术被应用到紫杉醇大批量生产中，可有效地解决紫杉醇的药用需求问题[6]。但是从目前来看，在采用植物组织培养技术进行红豆杉组织培养生产紫杉醇的过程中，由于培养基的问题，使得实际生产过程中红豆杉的组织的成活率和诱导率往往较低，给紫杉醇产量的提升带来了严重的阻碍[7]。

为此，本研究在传统的培养基体系基础上对其进行优化，以建立南方红豆杉愈伤组织高效诱导体系，提高红豆杉愈伤组织的诱导率和成活率，这对提高紫杉醇产量和质量具有非常重要意义。

1材料与方法

1.1材料

本研究中各试验使用的外植体材料类型如表1所示。

表1　各试验中使用的外植体类型

1.2方法1.2.1不同类型培养基的诱导愈伤组织试验

选取长势基本一致的新生南方红豆杉新生枝条和叶片组织，首先用中性洗涤剂去除其表面的灰尘，并用无菌蒸馏水清洗4～5次，用滤纸将其表面的水分吸干后再用75%的酒精对其进行杀菌消毒处理，消毒时长为1min，然后用0.1%的HgCl2对其进行消毒，消毒时间12min，再用无菌蒸馏水对其进行清洗5～6次，将组织切成2～5cm的茎段和1.5～2cm的切片，将外植体接种到B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE6种培养基中进行暗培养，培养环境温度为25℃，每组培养基接种100个茎段或者切片，在培养过程中按文献[8]的方法进行观察记录。

1.2.2不同组织的接种方法的诱导愈伤组织试验

选取长势基本一致的南方红豆杉的新生枝条和叶片组织，采用前述试验中的消毒处理方法进行处理后，将新生枝条和叶片组织处理成1～1.5cm的组织切面，接种于含有B5改良型培养基的三角瓶中进行暗培养，培养的环境温度为25℃。其中6种不同的接种方法如图1所示，每种接种方法接种100个，在培养过程中记录愈伤组织的诱导数和可继代愈伤组织数，并对红豆杉组织细胞进行评价。

图1　不同接种方法示意图

1.2.3调节剂对愈伤组织诱导及增殖影响试验

选取长势基本一致的红豆杉枝条组织，采用前述试验相同的消毒处理方法对其进行处理，切段接种于含有0.002mg/L TDZ、0.5mg/L 2，4-D、1.0mg/L 2，4-D、2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、1.0mg/L NAA、0.5mg/L KT、1.0mg/L KT的B5改良型培养基的三角瓶中进行暗培养，环境温度为25℃，记录1个继代周期的组织细胞增重、褐化率，对细胞进行评价。

因为PBL教学模式一般都是以小组的形式开展，所以，将学生进行合理地小组划分是最为关键的基础环节。小组划分应该以激发学生的参与积极性和主动性为基础，促使学生主动完成规定任务。教师则应对学生的英语口语水平进行综合评判，并根据水平差异进行小组划分，防止整体实力过强或者过弱。这样一来，才可以进一步避免在讨论的时候，出现强势或弱势极端群体。同时，教师还应在小组中，指定一名同学作为组长，负责小组成员的具体任务划分，并对小组成员的活动与讨论参与性进行实时监督。这就需要小组组长既具备良好的英语口语水平，又要具有一定的组织与管理能力。

1.2.4pH对愈伤组织诱导及增殖的影响试验

选取长势基本一致的南方红豆杉新生枝条，采用前述试验中相同的消毒方法，将其切片接种于pH为7.5、7、6.5、6、5.5的B5改良型培养中进行暗培养，培养的环境温度为25℃，每组培养基接种100个切片，培养30d时，记录愈伤组织的诱导数和可继代数。

1.3红豆杉组织细胞的生理评价

根据前期的预试验的观察和数据分析，本研究将南方红豆杉愈伤组织的颜色进行分级，分为5个颜色度，如图2所示。

1.白绿色，细胞透明、呈现玻璃状；2.白黄色，细胞较为透明；3.黄色，细胞不透明；4.深黄色，小部分褐化现象；5.土黄色，大部分褐化现象图2　红豆杉细胞颜色等级

对组织的细胞质地按照如图3所示的观测到的组织细胞分布来进行评价。

1.细胞松散，有水质细胞粘连；2.细胞松散，细胞含水量较高，细胞不粘连；3.细胞均匀，蓬松，细胞呈沙粒状聚集；4.细胞紧密，水份较低；5.细胞结块，缺水图3　红豆杉细胞质地等级

分析过程中采用如下计算公式对组织的可继代愈伤组织率、褐化率和细胞鲜重进行度量和计算，进而通过这3个指标参数来判断细胞的生理指标：

可继代愈伤组织率=(可继代细胞的质量/诱导愈伤组织质量)×100%

细胞鲜重=单位时间内细胞增加的质量(g)

2结果与分析

2.1不同类型培养基对愈伤组织诱导的影响

由表2可以看出，在不同类型培养基的愈伤组织的诱导试验中，诱导率从大到小分别为B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE，可继代细胞大小由大到小分别为B5改良型、B5、MS、SH、WPM、WHITE，B5改良型的培养基的愈伤组织诱导周期最短，细胞质地均匀，可继代细胞数目最多，B5改良型培养基显著优于其他类型培养基，更适合红豆杉组织的培养。

表2　不同类型培养基诱导愈伤组织的试验结果

2.2不同组织的接种方法对诱导愈伤组织的影响

由表3可以看出：在6种接种方法中，方法1、2和3的诱导率和可接种率都达到了100%；从时间上看，方法3的愈伤出现时间最长为11d，方法1的时间最短为8d，颜色和质地都一致；但从污染率上看，方法3具有明显的优势，只有1%的污染率。综合考虑，采用方法3无叶茎段进行接种可以有效地提高红豆杉组织培养的诱导率和可接种率，且污染率低，是最适合南方红豆杉愈伤组织诱导的接种方法。

表3　不同组织接种方法诱导愈伤组织试验结果

2.3调节剂对愈伤组织诱导及增殖的影响

调节剂对愈伤组织诱导及增殖影响试验得出的结果如表4所示。由表4可以看出，2,4-D、NAA的影响最为明显，2，4-D、NAA浓度越高愈伤组织的诱导率越高，细胞的质地也越好，愈伤组织的细胞可继代率越高，因此，在构建红豆杉组织培养体系中可通过添加2.0mg/L 2，4-D或1.0mg/LNAA进行调节，可以有效地改善细胞的质地、诱导率和可继代率。

表4　调节剂对愈伤组织诱导及增殖的影响试验结果

2.4pH对愈伤组织诱导及增殖的影响

由表5可以看出，在pH为6时南方红豆杉愈伤组织的诱导率和可继代率都较高。因此，在构建红豆杉培养体系中，pH应当控制在6左右。

表5　pH对愈伤组织诱导及增殖的影响试验结果

3结语

红豆杉作为提取紫杉醇药物的一种重要的植物，采用植物组织培养技术对其进行培养，是目前实现大批量的生产紫杉醇药物的最佳途径，是医药领域对紫杉醇需求的保障。本研究通过不同类型培养基的愈伤组织的诱导试验、不同组织的接种方法的诱导愈伤组织试验、调节剂对愈伤组织诱导及增殖影响试验和不同pH对愈伤组织诱导及增殖的影响试验，筛选出了适宜南方红豆杉愈伤组织诱导、组织细胞增殖的培养条件，从培养基的组成成分、生长调节剂、pH和接种方法4个方面建立了南方红豆杉愈伤组织高效诱导体系，可以有效地提高红豆杉愈伤组织诱导率和成活率，对提高紫杉醇生产效率具有非常重要的意义。

[参考文献]

[1]周玉洁.东北红豆杉与美丽镰刀菌的固定化法共生培养[D].无锡：江南大学,2008.

[2]赵晶.东北红豆杉细胞培养高效提取紫杉醇技术体系研究[D].长春：吉林大学,2014.

[3]刘丽丽.东北红豆杉开放式组培育苗关键技术研究[D].长春：吉林大学,2013.

[4]袁丽娜.东北红豆杉工厂化育苗生产模式优化及技术体系的构建[D].长春：吉林大学,2014.

[5]凡利.南方红豆杉细胞悬浮培养产紫杉醇的研究[D].长沙：中南林业科技大学,2012.

[6]杜亚填.南方红豆杉愈伤组织培养及其紫杉醇含量调控的优化研究[D].长沙：湖南农业大学,2006.

[7]胡新玲.红豆杉紫杉烷14β-羟基化酶基因植物表达载体的构建及转化的研究[D].北京：中国林业科学研究院,2007.

[8]翟雪霞,杨靖,李友勇.红豆杉高产细胞系快速建立和更新的新方法[J].生物技术通讯,2009,(3):376～379.

[收稿日期]2015-11-09

[基金项目]四川省教育厅科研项目(14ZB0390)。

[作者简介]郄亚微(1981-)，女，硕士，讲师，现主要从事园林植物生物技术研究，snowy5568@sina.com。