猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

杨秀芬，荣 俊，李国攀

(长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；长江大学生物医药研究所，湖北荆州434025)

黄巧珍

(浙江诺倍威生物技术有限公司，浙江 杭州 310000)



猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

杨秀芬，荣 俊，李国攀

(长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；长江大学生物医药研究所，湖北荆州434025)

黄巧珍

(浙江诺倍威生物技术有限公司，浙江 杭州 310000)

[摘要]根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物，通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段，分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒，PCR、酶切及测序鉴定表明，成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达，SDS-PAGE电泳分析表明，E.coli BL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白，而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白，可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。

[关键词]猪生殖与呼吸综合征病毒；M蛋白；原核表达

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，临床表现主要以妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征[1]。我国于1996年发现该病[2]，其后广泛地流行于全国各地[3]，并成为我国养猪生产中主要疫病之一。2006年以来，我国出现和流行以Nsp2编码区缺失30个氨基酸为分子特征的高致病性PRRSV，感染猪群出现高发病率和高死亡率，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[4,5]。

PRRSV是动脉炎病毒科、动脉炎病毒属、单股正链RNA病毒。其基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框(ORFs)，ORF1a和ORF1b编码蛋白聚合酶，ORF2～7 分别编码结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[6]。其中M蛋白分子量为18～19ku，为III型跨膜蛋白，且是非糖基化蛋白，由1个3次连续的疏水性跨膜区、13～18个氨基酸的胞外区和81～87个氨基酸的胞内区构成[7]。在PRRSV结构蛋白中，M蛋白的氨基酸序列在欧洲型和美洲型毒株之间最为保守，氨基酸同源性为78%～81%[8]。猪在感染PRRSV约10d后，可检测到针对 M 蛋白的特异性抗体。感染细胞中的 M 蛋白与 GP5 在细胞内质网上形成异源二聚体，这种结构在病毒的组装和释放中起重要作用[9]。此外，M 蛋白内部可以形成以二硫键结合的同型二聚体，这可能与病毒的感染力有关[10]。M 蛋白免疫原性较强，可以诱导机体产生中和抗体，且是引起细胞免疫应答最强的蛋白[11]。因此，M蛋白在PRRSV血清学诊断和疫苗开发领域有很好的应用前景。本研究通过设计特异性PCR引物对M蛋白进行全基因和截短表达的研究，使截短的M蛋白在大肠杆菌中获得表达，以为PRRSV诊断和疫苗研究奠定基础。

1材料与方法

1.1cDNA、质粒和试剂

PRRSV cDNA、原核表达质粒pET-28a(+)由长江大学生命科学学院动物科学实验室保存，pMD-18T 载体购自大连宝生物工程有限公司，E.coliDH5α、BL21(DE3)化学感受态细胞购自全式金生物技术有限公司，ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司，Trans2K Plus DNA Marker 、ProteinRuler I购自全式金生物技术有限公司，小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司，抗PRRSV阳性血清由浙江诺倍威生物技术有限公司质量管理部提供，HRP标记的羊抗猪IgG抗体购自KPL公司，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成

根据GenBank收录的PRRSV(AF046869)株M基因序列设计引物。引物序列见表1。其中5’-端下划线部分是附加的酶切位点，上游引物为EcoRⅠ，下游引物为XhoⅠ。所有引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

表1　PRRSV M基因引物列表

1.2.2目的基因的PCR扩增

以PRRSV cDNA为模板，使用上述引物PCR扩增M全序列和MNd67片段。反应条件均为：94℃5min；94℃45s，64℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，并切胶回收并纯化目的片段。

1.2.3重组表达载体的构建

纯化后的目的片段连接至pMD-18T载体，转化到DH5α化学感受态细胞，涂布于加有Amp的LB平板上培养。挑取单个菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性转化菌提取质粒连同表达质粒pET-28a(+)分别用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切，回收目的片段与载体片段，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化至DH5α化学感受态细胞，涂布于加有Kan的平板上培养。挑取单个菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性转化菌提取质粒并做双酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组质粒送往上海生工公司测序，构建的重组表达质粒分别命名为pET28a-PRRSV M及pET28a-PRRSV MNd67。

1.2.4目的基因的表达

将上述重组质粒转化到BL21(DE3)化学感受态细胞中，其转化菌分别命名为E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M和E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67。挑取单个菌落接种于LB培养基中培养10～12h，进行菌落PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌株按1%转接到LB培养基中，37℃振荡培养，当D600nm值为0.8～1.0时，加入0.6mol/L α-乳糖至终浓度为30mmol/L，诱导5～6h, 离心收集菌体。

1.2.5表达蛋白的SDS-PAGE鉴定与Western blot分析

用0.02mol/L pH7.4 PBS重悬菌体并用超声波破碎，分别收集破碎后的全菌液、上清液及沉淀。取破碎后的全菌液和上清液分别进行SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白的表达情况。对表达蛋白进行Western blot分析，以1∶100稀释的抗PRRSV阳性血清为一抗，1∶8000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG抗体为二抗，用DAB溶液显色并观察结果。

2结果与分析

2.1目的基因片段的扩增

M：Trans2K Plus DNA Marker；1～2：PRRSVMNd67；3～4：PRRSV M全基因图1　目的基因的扩增结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，发现在525bp和324bp处有特异性DNA扩增条带(图1)，与理论扩增产物长度相符。

2.2重组质粒鉴定结果

重组质粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67分别经EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别显示2条带且与载体和目的片段的大小相符(图2)。DNA测序结果与实验设计的序列一致，显示基因序列无碱基的插入与缺失，表明已正确构建了重组质粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67。

2.3SDS-PAGE与Western blot分析结果

含有各重组表达载体的阳性菌经α-乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳分析发现，E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的蛋白表达带，E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67在分子量大小为14ku处可见明显表达带，与预期大小相符，表达蛋白少量可溶(图3)。表达产物Western blot检测，未出现明显杂交条带。

M:Trans2KPlusDNAMarker;1:pET28a-PRRSVMNd67双酶切质粒;2:pET28a-PRRSVMNd67原始质粒;3:pET28a-PRRSVM双酶切质粒;4:pET28a-PRRSVM原始质粒图2 重组质粒的酶切鉴定结果1:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVM全菌液;2:pET28a空白菌表达上清液;3:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67全菌液;4:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67上清液;M:ProteinRulerI图3 PRRSVM蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析

3讨论

膜蛋白的表达一直是大肠杆菌表达系统应用的难点，许多膜蛋白由于疏水性氨基酸含量较高，表达出来的蛋白锚定在细胞膜上，从而对膜造成破坏导致细胞裂解，影响表达量。M蛋白为III型跨膜蛋白，是PRRSV囊膜基质蛋白，其N端含有3个疏水性比较高的跨膜区域，给其原核表达带来不便。从国内外的报道来看，已有多种表达系统用于表达重组M蛋白，均未获得理想结果。有报道称对ORF6基因进行改造，去除N端疏水区域后理论上对表达产物的抗原性不会产生太大影响，并且有利于M蛋白的表达量的提高。已有的研究成果以及在线跨膜区预测软件和抗原表位预测软件显示M蛋白N端的3个疏水性跨膜区位于氨基酸序列前100位，几乎所有抗原表位都位于氨基酸序列后100位[12]。戚亭等[13]去除了M蛋白N端疏水性较强的区域，表达了长约290bp PRRSV M融合蛋白，该蛋白仍然能够与抗PRRSV猪阳性血清发生特异性反应。邓静等[14]去除全部的编码疏水性跨膜区的核苷酸序列，对M蛋白从第104个氨基酸序列到C-端第4个氨基酸序列扩增，截短后的M基因获得了表达，且表达的M蛋白部分可溶、部分为包涵体，Western blot检测有明显杂交带。

本研究同时表达PRRSVM全蛋白和N-端截短67个氨基酸的PRRSV M蛋白。结果表明，全长的M蛋白诱导后未见明显表达，N端截短67个氨基酸的M蛋白诱导后表达了分子质量约为14ku的重组蛋白，且SDS-PAGE检测显示该重组M蛋白部分可溶，这与邓静等的[14]研究结果相符。但是截短表达的M蛋白Western blot检测未见明显杂交带，可能解释的原因一是Western blot使用的一抗血清为PRRSV 多克隆抗血清，未经纯化，效价较低；二是M蛋白主要引起机体的细胞免疫，而诱导机体产生的中和抗体的量有限，Western blot不易检出，这些都有待后续进一步研究。综上所述，本研究成功表达了截短的PRRSV M 蛋白，为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。

[参考文献]

[1]Rossow K D.Porcine reproductive and respiratory syndrome [J].Veterinary Pathology Online， 1998，35：1～20.

[2]郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似 PRRS 流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996，(2)：1～5.

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[4]Zhou L，Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus research， 2010，154：31～37.

[5]An T Q，Tian Z J，Xiao Y，etal. Origin of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，China[J].Emerging Infectious Diseases，2010，16：365～367.

[6]Madsen K G，Hansen C M，Madsen E S，etal.Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds [J].Archives of virology，1998，143：1683～1700.

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[12]袁明铭.猪繁殖与呼吸综合征M基因的原核表达与间接ELISA方法的建立[D].成都：四川农业大学，2013.

[13]戚亭，崔尚金，张超范.截短的猪生殖与呼吸综合征病毒 M 基因的原核表达[J].中国兽医科学，2008，38(6)：457～460.

[14]邓静，袁明铭，文心田，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒 M 基因的截短表达及间接 ELISA 检测方法的建立[J].中国兽医科学，2014(7)：734～741.

[收稿日期]2016-03-03

[作者简介]杨秀芬(1988-)，女，硕士生，研究方向为基因工程疫苗。通信作者：荣俊，496281344@qq.com。

[中图分类号]Q786

[文献标识码]A

[文章编号]1673-1409(2016)09-0046-04

[引著格式]杨秀芬，荣俊，李国攀,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达[J].长江大学学报(自科版) ，2016，13(9)：46～49.